Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан браузердин версиясында CSS колдоосу чектелүү. Эң жакшы натыйжаларга жетүү үчүн, браузериңиздин жаңы версиясын колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде Шайкештик режимин өчүрүп коюңуз). Ошол эле учурда, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, биз сайтты стилдештирбестен же JavaScriptсиз көрсөтүп жатабыз.
Табигый продуктуларды ачуу жана пайдалуу колдонуу адамдын жашоосун жакшыртууга жардам берет. Өсүмдүктөрдүн өсүшүн басаңдатуучу химиялык заттар отоо чөптөрдү көзөмөлдөө үчүн гербицид катары кеңири колдонулат. Ар кандай типтеги гербициддерди колдонуу зарылдыгынан улам, жаңы таасир этүү механизмдери бар кошулмаларды аныктоо зарылдыгы келип чыгат. Бул изилдөөдө биз Streptomyces werraensis MK493-CF1ден жаңы N-алкоксипиррол кошулмасын, кумамонамидди таап, толук синтез процессин негиздедик. Биологиялык активдүүлүк анализдери аркылуу биз урс-моноамид кислотасы урс-моноамиддин синтетикалык аралык продуктусу жана потенциалдуу...өсүмдүктөрдүн өсүшүн ингибиторлойтМындан тышкары, биз ар кандай урбенон кислотасынын туундуларын, анын ичинде HeLa клеткаларынын өсүшүнө терс таасирин тийгизбестен, жогорку гербициддик активдүүлүккө ээ болгон урбенилокси туундусун (UDA) иштеп чыктык. Ошондой эле, урмотон кислотасынын туундулары өсүмдүктүн микротүтүкчөлөрүн бузарын аныктадык; мындан тышкары, KAND актин жипчелерине таасир этет жана клеткалардын өлүмүнө алып келет; Бул көп кырдуу таасирлер белгилүү микротүтүкчөлөрдүн ингибиторлорунан айырмаланат жана урсон кислотасынын жаңы таасир этүү механизмин сунуштайт, бул жаңы гербициддерди иштеп чыгууда маанилүү артыкчылык болуп саналат.
Пайдалуу табигый продуктыларды жана алардын туундуларын ачуу жана практикалык колдонуу адам жашоосунун сапатын жакшыртуунун каражаты болуп саналат. Микроорганизмдер, өсүмдүктөр жана курт-кумурскалар тарабынан өндүрүлгөн экинчилик метаболиттер медицинада жана айыл чарбасында чоң жетишкендиктерге алып келди. Табигый продуктылардан көптөгөн антибиотиктер жана лейкемияга каршы дары-дармектер иштелип чыккан. Мындан тышкары, ар кандай түрлөрүпестициддер, фунгициддер жана гербициддер айыл чарбасында колдонуу үчүн бул табигый продуктулардан алынат. Атап айтканда, отоо чөптөргө каршы гербициддер заманбап айыл чарбасында түшүмдүүлүктү жогорулатуунун маанилүү куралдары болуп саналат жана ар кандай кошулмалардын түрлөрү коммерциялык жактан колдонулуп келет. Өсүмдүктөрдөгү фотосинтез, аминокислоталардын алмашуусу, клетка дубалынын синтези, митозду жөнгө салуу, фитогормон сигнализациясы же белок синтези сыяктуу бир нече клеткалык процесстер гербициддердин типтүү буталары болуп эсептелет. Микротүтүкчөлөрдүн функциясын басаңдатуучу кошулмалар митоздук жөнгө салууга таасир этүү менен өсүмдүктөрдүн өсүшүнө таасир этүүчү гербициддердин кеңири таралган классы болуп саналат2.
Микротүтүкчөлөр цитоскелеттин компоненттери болуп саналат жана эукариоттук клеткаларда кеңири сакталат. Тубулиндин гетеродимери α-тубулин жана β-тубулинден турат, алар сызыктуу микротүтүкчө протофиламенттерин түзөт, ал эми 13 протофиламент цилиндр формасындагы түзүлүштү түзөт. Микротүтүкчөлөр өсүмдүк клеткаларында клетканын формасын, клетканын бөлүнүшүн жана клетка ичиндеги ташууларды аныктоону камтыган бир нече ролду ойнойт3,4. Өсүмдүк клеткаларында фаза аралык плазма мембранасынын астында микротүтүкчөлөр бар жана бул кортикалдык микротүтүкчөлөр целлюлоза синтаза комплекстерин жөнгө салуу аркылуу целлюлоза микрофибриллдеринин уюштурулушун көзөмөлдөйт деп эсептелет4,5. Тамырдын учунун тез узаруу зонасында жайгашкан тамыр эпидермалдык клеткаларынын кортикалдык микротүтүкчөлөрү капталда жайгашкан жана целлюлоза микрофибралар бул микротүтүкчөлөрдү ээрчип, клетканын кеңейүү багытын чектеп, ошону менен анизотроптук клеткалардын узарышына өбөлгө түзөт. Ошондуктан, микротүтүкчөлөрдүн функциясы өсүмдүк морфологиясы менен тыгыз байланыштуу. Тубулинди коддогон гендердеги аминокислоталардын алмашуусу Арабидопсисте кортикалдык микротүтүкчөлөр массивдеринин кыйшайышына жана сол же оң тараптын өсүшүнө алып келет 6,7. Ошо сыяктуу эле, микротүтүкчөлөрдүн динамикасын жөнгө салуучу микротүтүкчөлөр менен байланышкан белоктордогу мутациялар тамырдын өсүшүнүн бузулушуна алып келиши мүмкүн8,9,10,11,12,13. Мындан тышкары, претилахлор деп да аталган дисопирамид сыяктуу микротүтүкчөлөрдү бузган гербициддер менен дарылоо да сол тараптын кыйгач тамыр өсүшүнө алып келет14. Бул маалыматтар микротүтүкчөлөрдүн функциясын так жөнгө салуу өсүмдүктүн өсүү багытын аныктоо үчүн абдан маанилүү экенин көрсөтүп турат.
Микротүтүкчөлөрдүн ингибиторлорунун ар кандай түрлөрү ачылган жана бул дары-дармектер цитоскелеттик изилдөөлөргө, ошондой эле айыл чарбасына жана медицинага олуттуу салым кошкон2. Атап айтканда, оризалин, динитроанилин кошулмалары, дизопирамид, бензамидге байланыштуу кошулмалар жана алардын аналогдору микротүтүкчөлөрдүн функциясын басаңдатып, ошону менен өсүмдүктөрдүн өсүшүн басаңдатышы мүмкүн. Ошондуктан, алар гербицид катары кеңири колдонулат. Бирок, микротүтүкчөлөр өсүмдүк жана жаныбарлар клеткаларынын маанилүү компоненти болгондуктан, көпчүлүк микротүтүкчөлөрдүн ингибиторлору эки клетканын тең түрүнө цитотоксикалык таасир этет. Ошондуктан, алардын гербицид катары таанылган пайдалуулугуна карабастан, практикалык максаттарда чектелген сандагы антимикротүтүкчөлүү агенттер колдонулат.
Streptomyces – Streptomyces тукумуна кирген уруу, ага аэробдук, грам-позитивдүү, жипче сымал бактериялар кирет жана кеңири диапазондогу экинчилик метаболиттерди өндүрүү жөндөмү менен белгилүү. Ошондуктан, ал жаңы биологиялык активдүү табигый продуктулардын эң маанилүү булактарынын бири деп эсептелет. Учурдагы изилдөөдө биз Streptomyces werraensis MK493-CF1 жана S. werraensis ISP 5486дан бөлүнүп алынган кумамонамид деп аталган жаңы кошулманы ачтык. Спектрдик анализ жана толук спектрдик анализди колдонуу менен кумамонамиддин түзүлүшү мүнөздөлүп, анын уникалдуу N-алкоксипиррол скелети аныкталды. синтези. Урсмон кислотасы, урсмонамиддин жана анын туундуларынын синтетикалык аралык заты, популярдуу модель өсүмдүгү Arabidopsis thalianaнын өсүшүнө жана өнүп чыгышына тоскоол болору аныкталган. Түзүлүш-активдүүлүк байланышын изилдөөдө биз урсон кислотасына модификацияланган C9 кошулмасы, урсон кислотасынын нонилоксиддик туундусу (KAND) деп аталган, өсүүгө жана өнүп чыгышына тоскоол болуучу таасирин бир кыйла күчөтөрүн аныктадык. Белгилей кетчү нерсе, жаңы ачылган өсүмдүктөрдүн өсүшүнүн ингибитору тамекинин жана боордун өсүшүнө да таасир эткен жана бактерияларга же HeLa клеткаларына цитотоксикалык таасир эткен эмес. Андан тышкары, кээ бир урмотон кислотасынын туундулары тамырдын фенотипинин бурмаланышын пайда кылат, бул туундулар микротүтүкчөлөргө түздөн-түз же кыйыр түрдө таасир этет дегенди билдирет. Бул идеяга ылайык, иммуногистохимиялык же флуоресценттик белоктор менен белгиленген микротүтүкчөлөрдү байкообуз KAND менен дарылоо микротүтүкчөлөрдү деполимерлештирерин көрсөтүп турат. Мындан тышкары, кумамотон кислотасынын туундулары менен дарылоо актин микрофиламенттерин бузган. Ошентип, биз цитоскелеттин бузулушун камтыган уникалдуу таасир этүү механизми бар жаңы өсүмдүктүн өсүшүнүн ингибиторун ачтык.
MK493-CF1 штаммы Токионун Шинагава-ку шаарында топурактан бөлүнүп алынган. MK493-CF1 штаммы жакшы бутактанган стромалдык мицелийди түзгөн. 16S рибосомалык РНК генинин (1422 bp) жарым-жартылай ырааттуулугу аныкталган. Бул штамм S. werraensisке абдан окшош (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типтүү штамм, 99,93%). Бул жыйынтыктын негизинде бул штамм S. werraensisтин типтүү штаммы менен тыгыз байланышта экени аныкталган. Ошондуктан, биз бул штаммды убактылуу S. werraensis MK493-CF1 деп атадык. S. werraensis ISP 5486T да ошол эле биоактивдүү кошулмаларды өндүрөт. Бул микроорганизмден табигый продуктыларды алуу боюнча алгачкы изилдөөлөр аз болгондуктан, андан ары химиялык изилдөөлөр жүргүзүлдү. S. werraensis MK493-CF1 арпа чөйрөсүндө 30°C температурада 14 күн бою катуу абалдагы ачытуу жолу менен өстүрүлгөндөн кийин, чөйрө 50% EtOH менен экстракцияланган. 59,5 мг чийки экстракт алуу үчүн 60 мл үлгү кургатылган. Чийки экстракт N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид (1, кумамонамид деп аталат, 36,0 мг) алуу үчүн тескери фазадагы HPLCге дуушар болгон. 1дин жалпы көлөмү чийки экстракттын болжол менен 60% түзөт. Ошондуктан, биз кумамотоамид 1дин касиеттерин деталдуу изилдөөнү чечтик.
Кумамонамид 1 ак аморфтук порошок жана жогорку чечилиштеги массалык спектрометрия (HRESIMS) C6H8N2O2 тастыктайт (1-сүрөт). Бул кошулманын C2 менен алмаштырылган пиррол фрагменти δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Гц, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H ЯМР спектринде: 4.5 Гц, H-5) жана δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Гц, H-6) менен мүнөздөлөт, ал эми 13C ЯМР спектринде төрт sp2 көмүртек атомунун бар экендиги көрсөтүлөт. C2 позициясында амид тобунун бар экендиги δC 161.1деги C-3 протонунан амид карбонил көмүртөгүнө HMBC корреляциясы аркылуу бааланган. Мындан тышкары, δH 4.10 (3H, S) жана δC 68.3 температураларында 1 H жана 13C ЯМР чокулары молекулада N-метокси топторунун бар экендигин көрсөтөт. Метокси тобунун туура абалы күчөтүлгөн айырма спектроскопиясы жана ядролук Overhauser кыскартуусу (NOEDF) сыяктуу спектроскопиялык анализдин жардамы менен аныктала элек болсо да, N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид биринчи талапкер кошулма болуп калды.
1дин туура түзүлүшүн аныктоо үчүн толук синтез жүргүзүлдү (2a-сүрөт). Сатыкта бар болгон 2-аминопиридин 2 m-CPBA менен иштетилгенде, сандык түшүмдүүлүк боюнча тиешелүү N-оксид 3 алынган. 2 2-аминоазидден кийин, Абрамович тарабынан сүрөттөлгөн циклоконденсация реакциясы бензолдо 90°C температурада жүргүзүлүп, каалаган 1-гидрокси-1H-пиррол-2-карбонитрил 5 грамм менен алынган. Ылдамдыгы 60% (эки этап). 15,16. Андан кийин 4 метилдештирүү жана гидролиздөө жакшы түшүмдүүлүктө (70%, эки этап) 1-метокси-1H-пиррол-2-карбон кислотасын ("кумототон кислотасы" деп аталат, 6) берген. Акырында, суу аммиакты колдонуп, кислота хлоридинин ортоңку 6 аркылуу амиддештирүү Кумамото амид 1 98% түшүмдүүлүк менен берген. Синтезделген 1дин бардык спектрдик маалыматтары бөлүнүп алынган 1ге окшош болгон, ошондуктан 1дин түзүлүшү аныкталган;
Урбенамиддин жана урбен кислотасынын биологиялык активдүүлүгүнүн жалпы синтези жана анализи. (а) Кумамото амидинин толук синтези. (б) Жети күндүк жапайы типтеги Arabidopsis Columbia (Col) көчөттөрү көрсөтүлгөн концентрацияларда кумамонамид 6 же кумамонамид 1 камтылган Мурашиге жана Скоог (MS) плиталарында өстүрүлдү. Масштаб тилкеси = 1 см.
Алгач, биз урбенамиддин жана анын ортоңку кошулмаларынын өсүмдүктөрдүн өсүшүн модуляциялоо жөндөмүнө жараша биологиялык активдүүлүгүн бааладык. Биз MS агар чөйрөсүнө ар кандай концентрациядагы урсмонамид 1 же урсмон кислотасы 6 кошуп, бул чөйрөдө Arabidopsis thaliana көчөттөрүн өстүрдүк. Бул анализдер 6нын жогорку концентрациясы (500 мкМ) тамырдын өсүшүнө тоскоол болорун көрсөттү (2б-сүрөт). Андан кийин, биз 6нын N1 позициясын алмаштыруу менен ар кандай туундуларды түздүк жана алар боюнча түзүлүш-активдүүлүк байланышын изилдөө жүргүздүк (аналогдук синтез процесси Кошумча маалыматта (SI) сүрөттөлгөн). Arabidopsis көчөттөрү 50 мкМ урсон кислотасынын туундуларын камтыган чөйрөдө өстүрүлдү жана тамырдын узундугу сүрөттө көрсөтүлгөндөй өлчөнгөн. 3a, b жана S1 сүрөттөрүндө көрсөтүлгөндөй, кумамо кислоталары N1 позициясында ар кандай узундуктагы сызыктуу алкокси чынжырларына (9, 10, 11, 12 жана 13) же чоң алкокси чынжырларына (15, 16 жана 17) ээ. Туундулар тамырдын өсүшүн олуттуу түрдө басаңдаткан. Мындан тышкары, биз 200 мкМ 10, 11 же 17 колдонуу өнүп чыгууну басаңдаткандыгын аныктадык (3c жана S2 сүрөттөрү).
Кумамото амидинин жана ага байланыштуу кошулмалардын түзүлүш-активдүүлүк байланышын изилдөө. (а) Аналогдордун түзүлүшү жана синтез схемасы. (б) 50 мкМ кумамонамид туундулары бар же жок MS чөйрөсүндө өстүрүлгөн 7 күндүк көчөттөрдүн тамырынын узундугун сандык аныктоо. Жылдызчалар жасалма дарылоо менен олуттуу айырмачылыктарды көрсөтөт (t-тест, p<0.05). n>18. Маалыматтар орточо ± SD катары көрсөтүлгөн. nt "текшерилген эмес" дегенди билдирет, анткени уруктардын 50% дан ашыгы өнүп чыккан эмес. (c) 200 мкМ кумамонамид жана ага байланыштуу кошулмалар кошулган же кошулбаган MS чөйрөсүндө 7 күн инкубацияланган иштетилген уруктардын өнүп чыгуу ылдамдыгын сандык жактан аныктоо. Жылдызчалар жасалма иштетүү менен олуттуу айырмачылыктарды көрсөтөт (хи-квадрат тести). n=96.
Кызыктуусу, C9дан узунураак алкил каптал чынжырларын кошуу ингибирлөөчү активдүүлүктү төмөндөткөн, бул кумамоит кислотасына байланыштуу кошулмалар өздөрүнүн биологиялык активдүүлүгүн көрсөтүү үчүн белгилүү бир өлчөмдөгү каптал чынжырларды талап кылаарын көрсөтүп турат.
Түзүлүш-активдүүлүк байланышын талдоо C9 урсон кислотасына өзгөртүлгөнүн жана урсон кислотасынын нонилокси туундусу (мындан ары KAND 11 деп аталат) өсүмдүктөрдүн өсүшүнүн эң натыйжалуу ингибитору болгонун көрсөткөндүктөн, биз KAND 11ди кененирээк мүнөздөдүк. Arabidopsisти 50 мкМ KAND 11 менен дарылоо өнүп чыгууну дээрлик толугу менен токтотту, ал эми KAND 11дин төмөнкү концентрациялары (40, 30, 20 же 10 мкМ) тамырдын өсүшүн дозага көз каранды түрдө токтотту (4a, b-сүрөт). KAND 11 тамыр меристемасынын жашоого жөндөмдүүлүгүнө таасир этеби же жокпу, текшерүү үчүн биз пропидий йодиди (PI) менен боёлгон тамыр меристемаларын карап чыгып, меристеманын аянтынын өлчөмүн өлчөдүк. 25 мкМ KAND-11 камтыган чөйрөдө өстүрүлгөн көчөттөрдүн меристемасынын өлчөмү 151,1 ± 32,5 мкм болгон, ал эми DMSO камтыган контролдук чөйрөдө өстүрүлгөн көчөттөрдүн меристемасынын өлчөмү 264,7 ± 30,8 мкм болгон (4c, d-сүрөт), бул KAND-11 клеткалык активдүүлүктү калыбына келтирерин көрсөтүп турат. жайылуу. Тамыр меристемасы. Буга ылайык, KAND 11 менен дарылоо тамыр меристемасында CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS клетка бөлүнүү маркеринин көлөмүн азайткан (4e-сүрөт) 17. Бул жыйынтыктар KAND 11 клеткалардын көбөйүү активдүүлүгүн азайтуу менен тамырдын өсүшүн басаңдатарын көрсөтүп турат.
Урбенон кислотасынын туундуларынын (урбенилокси туундуларынын) өсүүгө ингибирлөөчү таасирин талдоо. (а) KAND 11 көрсөтүлгөн концентрациялары менен MS плиталарында өстүрүлгөн 7 күндүк жапайы типтеги Col көчөттөрү. Масштаб тилкеси = 1 см. (б) Тамырдын узундугун сандык аныктоо. Тамгалар олуттуу айырмачылыктарды көрсөтөт (Tukey HSD тести, б.<0.05). n>16. Маалыматтар орточо ± SD катары көрсөтүлгөн. (c) 25 мкМ KAND менен же ансыз MS плиталарында өстүрүлгөн пропидий йодид менен боёлгон жапайы типтеги Col тамырларынын конфокалдык микроскопиясы 11. Ак кашаалар тамыр меристемасын көрсөтөт. Масштаб тилкеси = 100 мкм. (d) Тамыр меристемасынын өлчөмүн сандык аныктоо (n = 10дон 11ге чейин). Статистикалык айырмачылыктар t-тесттин жардамы менен аныкталган (p< 0,05). Сызыкчалар меристеманын орточо өлчөмүн көрсөтөт. (e) CDKB2 конструкциясын камтыган тамыр меристеманын дифференциалдык интерференциялык контраст (DIC) микроскопиясы; 1pro: CDKB2; 25 мкМ KAND анализи менен же ансыз MS пластиналарында өстүрүлгөн 5 күндүк көчөттөрдө 1-GUS боёлгон жана боёлгон.
KAND 11дин фитотоксикалык касиети дагы бир эки үлүштүү өсүмдүк, тамеки (Nicotiana tabacum) жана кургактыктагы өсүмдүктүн негизги моделдик организми, боор чөбүн (Marchantia polymorpha) колдонуу менен андан ары текшерилген. Arabidopsis сыяктуу эле, 25 мкм KAND 11 камтыган чөйрөдө өстүрүлгөн тамекинин SR-1 көчөттөрү кыска тамырларды пайда кылган (5а-сүрөт). Мындан тышкары, 48 үрөндүн 40ы 200 мкм KAND 11 камтыган тарелкаларда өнүп чыккан, ал эми бардык 48 үрөн макет менен иштетилген чөйрөдө өнүп чыккан, бул KANDдын жогорку концентрациясы олуттуу экенин көрсөтүп турат (б.<0,05; хи тести -квадрат) тамекинин өнүп чыгышын басаңдатты. (5b-сүрөт). Мындан тышкары, боор чөбүндөгү бактериялардын өсүшүн басаңдаткан KAND 11дин концентрациясы Arabidopsisтеги натыйжалуу концентрацияга окшош болгон (5c-сүрөт). Бул жыйынтыктар KAND 11 ар кандай өсүмдүктөрдүн өсүшүн басаңдата аларын көрсөтүп турат. Андан кийин биз башка организмдердеги, атап айтканда, адамдын HeLa клеткаларындагы жана Escherichia coli штаммындагы DH5α штаммындагы аюу моноамидине байланыштуу кошулмалардын мүмкүн болгон цитотоксикалык касиеттерин изилдедик, алар тиешелүүлүгүнө жараша жогорку жаныбарлардын жана бактериялык клеткалардын өкүлдөрү катары. Клеткалардын көбөйүүсүнө жүргүзүлгөн бир катар анализдерде биз кумамонамид 1, кумамонамид кислотасы 6 жана KAND 11 100 мкМ концентрацияда HeLa же E. coli клеткаларынын өсүшүнө таасир этпегенин байкадык (5d,e-сүрөт).
Arabidopsis эмес организмдерде KAND 11дин өсүшүн басаңдатуу. (а) Эки жумалык жапайы типтеги SR-1 тамеки көчөттөрү 25 мкМ KAND 11 камтыган вертикалдуу жайгаштырылган MS плиталарында өстүрүлдү. (б) Эки жумалык жапайы типтеги SR-1 тамеки көчөттөрү 200 мкМ KAND 11 камтыган горизонталдуу жайгаштырылган MS плиталарында өстүрүлдү. (в) Көрсөтүлгөн концентрациядагы KAND 11 менен Gamborg B5 плиталарында өстүрүлгөн эки жумалык жапайы типтеги Tak-1 боор чөбүнүн бүчүрлөрү. Кызыл жебелер эки жумалык инкубация мезгилинде өсүшүн токтоткон спораларды көрсөтөт. (г) HeLa клеткаларынын клетка көбөйүүсүн анализдөө. Жашоого жөндөмдүү клеткалардын саны клеткаларды эсептөө комплекти 8 (Dojindo) аркылуу белгиленген убакыт аралыгында өлчөнгөн. Контролдук катары HeLa клеткалары РНК полимераза транскрипциясын басаңдатып, клетканын өлүмүнө алып келүүчү 5 мкг/мл актиномицин D (D актысы) менен иштетилген. Анализдер үч жолу жүргүзүлдү. (д) E. coli клеткаларынын көбөйүүсүн анализдөө. E. coli өсүшү OD600 өлчөө менен талданган. Контролдук топ катары клеткаларга бактериялык клетка дубалынын синтезин басаңдатуучу 50 мкг/мл ампициллин (Amp) берилген. Анализдер үч жолу жүргүзүлдү.
Урамидге байланыштуу кошулмалардан келип чыккан цитотоксикалык таасир механизмин чечмелөө үчүн, биз орточо ингибирлөөчү таасири бар урбен кислотасынын туундуларын кайра талдап чыктык. Сүрөттө көрсөтүлгөндөй. 2b, 6a сүрөттөрүндө көрсөтүлгөндөй, урмотон кислотасынын 6 жогорку концентрациясын (200 мкМ) камтыган агар плиталарында өстүрүлгөн көчөттөр кыска жана солго ийилген тамырларды пайда кылган (θ = – 23,7 ± 6,1), ал эми контролдук чөйрөдө өстүрүлгөн көчөттөр дээрлик түз тамырларды пайда кылган (θ = – 3,8 ± 7,1). Бул мүнөздүү кыйгач өсүү кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн дисфункциясынан келип чыгаары белгилүү14,18. Бул ачылышка ылайык, микротүтүкчөлөрдү туруксуздаштыруучу дизопирамид жана оризалин дарылары биздин өсүү шарттарыбызда тамырдын окшош кыйшайышын пайда кылган (2b, 6a сүрөттөр). Ошол эле учурда, биз урмотон кислотасынын туундуларын сынап көрдүк жана белгилүү бир концентрацияларда кыйгач тамырдын өсүшүн пайда кылган бир нечесин тандап алдык. 8, 9 жана 15 кошулмалары тиешелүүлүгүнө жараша 75 мкМ, 50 мкМ жана 40 мкМде тамырдын өсүү багытын өзгөрттү, бул кошулмалар микротүтүкчөлөрдү натыйжалуу туруксуздаштыра аларын көрсөтүп турат (2b, 6a-сүрөт). Ошондой эле, биз эң күчтүү урсол кислотасынын туундусу KAND 11ди төмөнкү концентрацияда (15 мкМ) сынап көрдүк жана KAND 11ди колдонуу тамырдын өсүшүнө тоскоол болорун жана тамырдын өсүү багыты бирдей эмес экенин, бирок алар солго эңкейишке жакын экенин аныктадык (C3-сүрөт). Микротүтүкчөлөрдү туруксуздаштыруучу дары-дармектердин жогорку концентрациясы кээде тамырдын кыйшайышына алып келбестен, өсүмдүктүн өсүшүнө тоскоол болгондуктан, кийинчерээк биз KAND 11дин тамыр эпидермалдык клеткаларындагы кортикалдык микротүтүкчөлөрдү байкоо менен микротүтүкчөлөргө таасир этиши мүмкүндүгүн бааладык. 25 мкМ KAND 11 менен дарыланган көчөт тамырларынын эпидермалдык клеткаларында анти-β-тубулин антителолорун колдонуу менен иммуногистохимия узаруу зонасындагы эпидермалдык клеткалардагы дээрлик бардык кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн жок болуп кетишин көрсөттү (6б-сүрөт). Бул жыйынтыктар кумамотон кислотасы жана анын туундулары микротүтүкчөлөргө түз же кыйыр түрдө таасир этип, аларды бузарын жана бул кошулмалар жаңы микротүтүкчөлөрдүн ингибиторлору экенин көрсөтүп турат.
Урсон кислотасы жана анын туундулары Arabidopsis thaliana өсүмдүгүндөгү кортикалдык микротүтүкчөлөрдү өзгөртөт. (а) Көрсөтүлгөн концентрацияларда ар кандай урмотон кислотасынын туундуларынын катышуусунда өлчөнгөн тамырдын эңкейиш бурчу. Микротүтүкчөлөрдү ингибирлей турган эки кошулманын: дизопирамид жана оризалиндин таасири да талданган. Киргизилген сүрөттө тамырдын өсүү бурчун өлчөө үчүн колдонулган стандарт көрсөтүлгөн. Жылдызчалар жасалма дарылоо менен олуттуу айырмачылыктарды көрсөтөт (t-тест, p<0.05). n>19. Масштаб тилкеси = 1 см. (b) Узаруу зонасындагы эпидермалдык клеткалардагы кортикалдык микротүтүкчөлөр. 25 мкМ KAND 11 менен же ансыз MS пластинкаларында өстүрүлгөн жапайы типтеги Arabidopsis Col тамырларындагы микротүтүкчөлөр β-тубулиндин баштапкы антителолорун жана Alexa Fluor менен конъюгацияланган экинчилик антителолорду колдонуу менен иммуногистохимиялык боёо аркылуу көрсөтүлгөн. Масштаб тилкеси = 10 мкм. (c) Тамыр меристемасында микротүтүкчөлөрдүн митоздук түзүлүшү. Микротүтүкчөлөр иммуногистохимиялык боёо аркылуу көрсөтүлгөн. Профаза зоналарын, ийне жалбырактарын жана фрагмопласттарды камтыган митоздук түзүлүштөр конфокалдык сүрөттөрдөн саналган. Жебелер митоздук микротүтүкчөлөрдүн түзүлүштөрүн көрсөтөт. Жылдызчалар жасалма дарылоо менен олуттуу айырмачылыктарды көрсөтөт (t-тест, p<0.05). n>9. Масштаб тилкеси = 50 мкм.
Ursa микротүтүкчөлөрдүн функциясын бузуу жөндөмүнө ээ болгону менен, анын таасир этүү механизми типтүү микротүтүкчө деполимерлөөчү агенттерден айырмаланат деп күтүлүүдө. Мисалы, дизопирамид жана оризалин сыяктуу микротүтүкчө деполимерлөөчү агенттердин жогорку концентрациясы эпидермалдык клеткалардын анизотроптук кеңейишин пайда кылат, ал эми KAND 11 пайда кылбайт. Мындан тышкары, KAND 11 жана дисопирамидди бирге колдонуу дисопирамид менен шартталган тамырдын өсүшүнө жооп кайтарууга алып келди жана KAND 11 менен шартталган өсүүнү басаңдатуу байкалган (S4-сүрөт). Ошондой эле, биз өтө сезгич дисопирамид 1-1 (phs1-1) мутантынын KAND 11ге болгон реакциясын талдап чыктык. phs1-1 канондук эмес тубулин киназа чекитинин мутациясына ээ жана дисопирамид9,20 менен иштетилгенде кыска тамырларды пайда кылат. KAND 11 камтыган агар чөйрөсүндө өстүрүлгөн phs1-1 мутант көчөттөрүнүн тамырлары дисопирамидде өстүрүлгөндөргө окшош кыска болгон (S5-сүрөт).
Мындан тышкары, биз KAND 11 менен иштетилген көчөттөрдүн тамыр меристемасында профаза зоналары, ийнелер жана фрагмопласттар сыяктуу митоздук микротүтүкчөлөрдүн түзүлүштөрүн байкадык. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS боюнча байкоолорго ылайык, митоздук микротүтүкчөлөрдүн санынын олуттуу азайышы байкалган (6c-сүрөт).
KAND 11дин субклеткалык резолюциядагы цитотоксикалык касиетин мүнөздөө үчүн, биз тамекинин BY-2 суспензия клеткаларын KAND 11 менен дарылап, алардын реакциясын байкадык. KAND 11дин кортикалдык микротүтүкчөлөргө тийгизген таасирин баалоо үчүн алгач микротүтүкчөлөрдү флуоресценттик түрдө белгилеген TagRFP-TUA6 экспрессиялаган BY-2 клеткаларына KAND 11 коштук. Кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн тыгыздыгы цитоплазмалык пикселдердин арасындагы цитоскелеттик пикселдердин пайызын сандык жактан аныктаган сүрөт анализи аркылуу бааланган. Анализдин жыйынтыктары көрсөткөндөй, 50 мкМ же 100 мкМ KAND 11 менен 1 саат бою дарылангандан кийин, тыгыздык тиешелүүлүгүнө жараша 0,94 ± 0,74% же 0,23 ± 0,28% га чейин олуттуу төмөндөгөн, ал эми DMSO менен дарыланган клеткалардын тыгыздыгы 1,61 ± 0,34% түзгөн (7а-сүрөт). Бул жыйынтыктар Arabidopsisтеги KAND 11 менен дарылоо кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн деполимеризациясын пайда кылат деген байкоого дал келет (6b-сүрөт). Ошондой эле, биз KAND 11дин ошол эле концентрациясы менен дарылоодон кийин GFP-ABD менен белгиленген актин жипчелери бар BY-2 линиясын карап чыктык жана KAND 11 менен дарылоо актин жипчелерин бузганын байкадык. 50 мкМ же 100 мкМ KAND 11 менен 1 саат бою дарылоо актин жипчелеринин тыгыздыгын тиешелүүлүгүнө жараша 1,20 ± 0,62% же 0,61 ± 0,26% га чейин олуттуу түрдө төмөндөттү, ал эми DMSO менен дарылоодон өткөн клеткалардагы тыгыздык 1,69 ± 0,51% ды түздү (2-сүрөт). 7b). Бул жыйынтыктар актин жипчелерине таасир этпеген пропизамиддин жана микротүтүкчөлөргө таасир этпеген актин деполимеризатору латрункулин Внин таасири менен карама-каршы келет (SI S6-сүрөт). Мындан тышкары, кумамонамид 1, кумамонамид кислотасы 6 же KAND 11 менен дарылоо HeLa клеткаларындагы микротүтүкчөлөргө таасир эткен эмес (SI S7-сүрөт). Ошентип, KAND 11дин таасир этүү механизми белгилүү цитоскелеттин бузулуучуларынан айырмаланат деп эсептелет. Мындан тышкары, KAND 11 менен дарыланган BY-2 клеткаларын микроскопиялык байкообуз KAND 11 менен дарылоо учурунда клеткалардын өлүмүнүн башталышын көрсөттү жана Эванстын көк түстөгү өлгөн клеткаларынын үлүшү KAND 11 менен дарылоонун 30 мүнөтүнөн кийин олуттуу көбөйбөгөнүн көрсөттү, ал эми 50 мкМ же 100 мкМ KAND менен дарылоонун 90 мүнөтүнөн кийин өлгөн клеткалардын саны тиешелүүлүгүнө жараша 43,7% же 80,1% га чейин көбөйдү (7c-сүрөт). Жалпысынан алганда, бул маалыматтар жаңы урсол кислотасынын туундусу KAND 11 мурда белгисиз таасир этүү механизми бар өсүмдүккө мүнөздүү цитоскелеттик ингибитор экенин көрсөтүп турат.
KAND кортикалдык микротүтүкчөлөргө, актин жипчелерине жана тамекинин BY-2 клеткаларынын жашоого жөндөмдүүлүгүнө таасир этет. (а) TagRFP-TUA6 катышуусунда BY-2 клеткаларындагы кортикалдык микротүтүкчөлөрдү визуалдаштыруу. KAND 11 (50 мкМ же 100 мкМ) же DMSO менен дарыланган BY-2 клеткалары конфокалдык микроскопия аркылуу изилденген. Кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн тыгыздыгы 25 көз карандысыз клетканын микрографияларынан эсептелген. Тамгалар олуттуу айырмачылыктарды көрсөтөт (Tukey HSD тести, б.< 0,05). Масштаб тилкеси = 10 мкм. (b) GFP-ABD2 катышуусунда көрсөтүлгөн BY-2 клеткаларындагы кортикалдык актин жипчелери. KAND 11 (50 мкМ же 100 мкМ) же DMSO менен дарыланган BY-2 клеткалары конфокалдык микроскопия аркылуу изилденген. Кортикалдык актин жипчелеринин тыгыздыгы 25 көз карандысыз клетканын микрографияларынан эсептелген. Тамгалар олуттуу айырмачылыктарды көрсөтөт (Tukey HSD тести, б.< 0,05). Масштаб тилкеси = 10 мкм. (c) Эванс көк боёгу менен өлгөн BY-2 клеткаларын байкоо. KAND 11 (50 мкМ же 100 мкМ) же DMSO менен иштетилген BY-2 клеткалары жарык талаалуу микроскопия аркылуу текшерилген. n=3. Масштаб тилкеси = 100 мкм.
Жаңы табигый продуктылардын ачылышы жана колдонулушу медицина жана айыл чарбасын кошо алганда, адам жашоосунун ар кандай тармактарында олуттуу жетишкендиктерге алып келди. Жаратылыш ресурстарынан пайдалуу кошулмаларды алуу үчүн тарыхый изилдөөлөр жүргүзүлдү. Атап айтканда, актиномицеттер нематодалар үчүн мите курттарга каршы антибиотиктер катары пайдалуу экени белгилүү, анткени алар ар кандай экинчилик метаболиттерди, мисалы, ивермектиндин коргошун кошулмасы болгон авермектинди жана блеомицинди жана анын туундуларын өндүрүү жөндөмүнө ээ, алар ракка каршы каражат катары медициналык максатта колдонулат21,22. Ошо сыяктуу эле, актиномицеттерден ар кандай гербициддик кошулмалар табылган, алардын айрымдары буга чейин коммерциялык максатта колдонулуп келет1,23. Ошондуктан, каалаган биологиялык активдүүлүгү бар табигый продуктыларды бөлүп алуу үчүн актиномицет метаболиттерин талдоо натыйжалуу стратегия деп эсептелет. Бул изилдөөдө биз S. werraensisтен жаңы кошулма, кумамонамидди таап, аны ийгиликтүү синтездедик. Урсон кислотасы - урбенамиддин жана анын туундуларынын синтетикалык аралык продуктусу. Ал мүнөздүү тамырлардын бүктөлүшүнө алып келиши, орточо жана күчтүү гербициддик активдүүлүктү көрсөтүшү жана өсүмдүктүн микротүтүкчөлөрүнө түз же кыйыр түрдө зыян келтириши мүмкүн. Бирок, урмотон кислотасынын таасир этүү механизми учурдагы микротүтүкчөлөрдүн ингибиторлорунан айырмаланышы мүмкүн, анткени KAND 11 актин жипчелерин да бузуп, клеткалардын өлүмүнө алып келет, бул урмотон кислотасынын жана анын туундуларынын цитоскелеттик түзүлүштөрдүн кеңири диапазонуна таасир этүүчү жөнгө салуу механизмин көрсөтүп турат.
Урбенон кислотасынын андан ары деталдуу мүнөздөмөсү урбенон кислотасынын таасир этүү механизмин жакшыраак түшүнүүгө жардам берет. Атап айтканда, кийинки максат - урсон кислотасынын редукцияланган микротүтүкчөлөргө байлануу жөндөмүн баалоо, урсон кислотасы жана анын туундулары микротүтүкчөлөргө түздөн-түз таасир этеби жана аларды деполимерлештиреби же алардын таасири микротүтүкчөлөрдүн туруксуздугуна алып келеби же жокпу, аныктоо. Мындан тышкары, микротүтүкчөлөр түз бута болбогон учурда, өсүмдүк клеткаларындагы урсон кислотасынын таасир этүү ордун жана молекулярдык буталарын аныктоо тиешелүү кошулмалардын касиеттерин жана гербициддик активдүүлүктү жакшыртуунун мүмкүн болгон жолдорун тереңирээк түшүнүүгө жардам берет. Биздин биоактивдүүлүк анализибиз урсон кислотасынын Arabidopsis thaliana, тамеки жана боор чөбү сыяктуу өсүмдүктөрдүн өсүшүнө уникалдуу цитотоксикалык жөндөмүн көрсөттү, ал эми E. coli да, HeLa клеткалары да жабыркаган жок. Урсон кислотасынын туундулары ачык айыл чарба талааларында колдонуу үчүн гербицид катары иштелип чыкса, алардын жаныбарлардын клеткаларына уулуулугу аз же такыр жок болушу артыкчылык болуп саналат. Чынында эле, микротүтүкчөлөр эукариоттордо кеңири таралган түзүлүштөр болгондуктан, өсүмдүктөрдөгү алардын тандалма ингибирлениши гербициддер үчүн негизги талап болуп саналат. Мисалы, тубулинге түздөн-түз байланышып, полимерленүүнү басуучу микротүтүкчөлөрдү деполимерлөөчү агент пропизамид жаныбарлардын клеткаларына уулуулугу төмөн болгондуктан, гербицид катары колдонулат24. Дизопирамидден айырмаланып, окшош бензамиддер ар кандай максаттуу өзгөчөлүктөргө ээ. Өсүмдүктөрдүн микротүтүкчөлөрүнөн тышкары, RH-4032 же бензоксамид дагы жаныбарлардын клеткаларынын же оомицеттердин микротүтүкчөлөрүн басат, ал эми залиламид фитотоксикалык деңгээли төмөн болгондуктан, фунгицид катары колдонулат25,26,27. Жаңы ачылган аюу жана анын туундулары өсүмдүктөргө карата тандалма цитотоксикалык касиетке ээ, бирок андан аркы модификациялар алардын максаттуу өзгөчөлүгүн өзгөртүшү мүмкүн экенин белгилей кетүү керек, бул патогендик козу карындарды же оомицеттерди көзөмөлдөө үчүн кошумча туундуларды камсыз кылышы мүмкүн.
Урбенон кислотасынын жана анын туундуларынын уникалдуу касиеттери аларды гербицид катары иштеп чыгуу жана изилдөө куралдары катары колдонуу үчүн пайдалуу. Цитоскелеттин өсүмдүк клеткасынын формасын көзөмөлдөөдөгү мааниси кеңири таанылган. Мурдагы изилдөөлөр өсүмдүктөр морфогенезди туура көзөмөлдөө үчүн микротүтүкчөлөрдүн динамикасын көзөмөлдөө аркылуу кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн уюштурулушунун татаал механизмдерин өнүктүргөнүн көрсөттү. Микротүтүкчөлөрдүн активдүүлүгүн жөнгө салууга жооптуу көптөгөн молекулалар аныкталган жана ага байланыштуу изилдөөлөр дагы эле уланууда3,4,28. Өсүмдүк клеткаларындагы микротүтүкчөлөрдүн динамикасы жөнүндөгү азыркы түшүнүгүбүз кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн уюштурулушунун механизмдерин толук түшүндүрө албайт. Мисалы, дизопирамид да, оризалин да микротүтүкчөлөрдү деполимерлештире алса да, дизопирамид тамырдын катуу деформациясын пайда кылат, ал эми оризалин салыштырмалуу жеңил таасирге ээ. Андан тышкары, микротүтүкчөлөрдү турукташтыруучу тубулиндеги мутациялар тамырларда декстроротацияны да пайда кылат, ал эми микротүтүкчөлөрдүн динамикасын да турукташтыруучу паклитаксел андай эмес. Ошондуктан, урсол кислотасынын молекулярдык буталарын изилдөө жана аныктоо өсүмдүктүн кортикалдык микротүтүкчөлөрүнүн жөнгө салынышына жаңы түшүнүктөрдү бериши керек. Ошо сыяктуу эле, келечекте дисопирамид сыяктуу бурмаланган өсүштү стимулдаштырууда натыйжалуу болгон химиялык заттарды жана оризалин же кумамотор кислотасы сыяктуу анча натыйжалуу эмес химиялык заттарды салыштыруу бурмаланган өсүү кантип болорун көрсөтүп турат.
Башка жагынан алганда, коргонууга байланыштуу цитоскелеттик кайра түзүлүштөр урсон кислотасынын цитотоксикалык таасирин түшүндүрүүнүн дагы бир мүмкүнчүлүгү болуп саналат. Патогендин инфекциясы же өсүмдүк клеткаларына элиситордун киргизилиши кээде цитоскелеттин бузулушуна жана андан кийинки клеткалардын өлүмүнө алып келет29. Мисалы, оомицеттерден алынган криптоксантин тамеки клеткаларынын өлүмүнө чейин микротүтүкчөлөрдү жана актин жипчелерин бузары кабарланган, бул KAND менен дарылоодо болгондой30,31. Коргонуу реакциялары менен урсон кислотасы тарабынан индукцияланган клеткалык реакциялардын ортосундагы окшоштуктар бизди алар жалпы клеткалык процесстерди козгойт деген гипотезага алып келди, бирок урсон кислотасынын криптоксантинге караганда тезирээк жана күчтүүрөөк таасири айкын. Бирок, изилдөөлөр актин жипчелеринин бузулушу клеткалардын өзүнөн-өзү өлүмүнө алып келерин көрсөттү, бул дайыма эле микротүтүкчөлөрдүн бузулушу менен коштолбойт29. Мындан тышкары, урсон кислотасынын туундулары сыяктуу эле, патоген же элиситор тамырдын бурмаланган өсүшүнө алып келеби же жокпу, белгисиз бойдон калууда. Ошентип, коргонуу реакцияларын жана цитоскелетти байланыштырган молекулярдык билим чечиле турган жагымдуу көйгөй болуп саналат. Урсон кислотасына байланыштуу төмөнкү молекулярдык салмактагы кошулмалардын, ошондой эле ар кандай потенциалга ээ болгон бир катар туундулардын болушун пайдалануу менен, алар белгисиз клеткалык механизмдерди бутага алуу мүмкүнчүлүктөрүн бериши мүмкүн.
Жалпысынан алганда, микротүтүкчөлөрдүн динамикасын модуляциялоочу жаңы кошулмаларды ачуу жана колдонуу өсүмдүк клеткасынын формасын аныктоонун негизинде жаткан татаал молекулярдык механизмдерди чечүү үчүн күчтүү ыкмаларды камсыз кылат. Бул контекстте, микротүтүкчөлөргө жана актин жипчелерине таасир этүүчү жана клеткалардын өлүмүнө алып келүүчү жакында эле иштелип чыккан урмотон кислотасы кошулмасы микротүтүкчөлөрдү башкаруу менен ушул башка механизмдердин ортосундагы байланышты чечмелөөгө мүмкүнчүлүк бериши мүмкүн. Ошентип, урбенон кислотасын колдонуу менен химиялык жана биологиялык анализ бизге өсүмдүк цитоскелетин башкарган молекулярдык жөнгө салуу механизмдерин түшүнүүгө жардам берет.
S. werraensis MK493-CF1ди 2% (w/v) галактозадан, 2% (w/v) эссенция пастасынан, 1% (w/v) Bacto курамынан турган 110 мл үрөн чөйрөсү бар 500 мл таң калыштуу Эрленмейер колбасына эгилет. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) жүгөрү экстрактысынан (KOGOSTCH Co., Ltd., Япония), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 жана 0,2% CaCO3 деиондоштурулган сууда (стерилдөөдөн мурун рН 7,4). Үрөн культуралары айланма чайкоочу машинада (180 айн/мин) 27°C температурада 2 күн инкубацияланган. Катуу абалдагы ачытуу аркылуу өндүрүштү өстүрүү. Үрөн культурасы (7 мл) 15 г пресстелген арпадан (MUSO Co., Ltd., Япония) жана 25 г деиондоштурулган суудан (стерилдөөдөн мурун рН туураланбаган) турган 40 г өндүрүштүк чөйрөнү камтыган 500 мл К-1 колбасына салынды. Ачытуу 30°C температурада караңгы жерде 14 күн бою жүргүзүлдү. Ачытуу материалы 40 мл/бөтөлкө EtOH менен экстракцияланып, центрифугаланды (1500 г, 4°C, 10 мүнөт). Культуранын үстүнкү катмары (60 мл) 10% MeOH/EtOAc аралашмасы менен экстракцияланды. Органикалык катмар төмөндөтүлгөн басым астында калдык (59,5 мг) алуу үчүн бууландырылган, ал градиенттүү элюция менен (0–10 мүнөт: 90%) тескери фазалуу колонкада (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID 10 мм × узундугу 250 мм) HPLCге дуушар болгон, 10–35 мүнөт: 90% H2O/CH3CNден 70% H2O/CH3CNге чейин (градиент), 35–45 мүнөт: 90% H2O/EtOH, 45–155 мүнөт: 90% H2O/EtOHдон 100% EtOHго чейин (градиент (градиент), 155–200 мүнөт: 100% EtOH) 1,5 мл/мин агым ылдамдыгында, кумамонамид (1,36,0 мг) ак аморфтук порошок катары бөлүнүп алынган.
Кумамотоамид(1); 1H-ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Гц, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Гц 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Гц, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ эсептелген мааниси: 141.0659, өлчөнгөн мааниси: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Колумбия уруктары (Col-0) изилдөө жүргүзүү үчүн уруксат менен Arabidopsis биологиялык ресурстар борборунан (ABRC) алынган. Col-0 уруктары биздин лабораториялык шарттарда көбөйтүлүп, сакталып, жапайы типтеги Arabidopsis өсүмдүктөрү катары колдонулган. Arabidopsis уруктары үстүртөн стерилденип, 2% сахароза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-морфолино)этансульфон кислотасы (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) жана 1,5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical) камтыган жарым күчтүү Murashige жана Skoog чөйрөсүндө, рН 5,7де, 23 °C температурада жана туруктуу жарыкта өстүрүлгөн. phs1-1 мутантынын уруктары Т. Хашимото (Нара илим жана технология институту) тарабынан берилген.
SR-1 штаммынын уруктары Т. Хашимото (Нара илим жана технология институту) тарабынан берилген жана жапайы типтеги тамеки өсүмдүктөрү катары колдонулган. Тамекинин уруктары өнүп чыгышын тездетүү үчүн үстүртөн стерилденип, үч түн стерилдүү сууга чыланган, андан кийин 2% сахароза, 0,05% (салмак/көлөм) MES жана 0,8% геллан сагызы (Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурашиге жана Скоог чөйрөсүнөн турган рН 5,7 бар жарым күчтүү эритмеге салынып, 23°C температурада туруктуу жарык астында инкубацияланган.
Tak-1 штаммы Т. Кохчи (Киото университети) тарабынан берилген жана боорду изилдөө үчүн стандарттуу эксперименталдык бирдик катары колдонулган. Гемма стерилденген өстүрүлгөн өсүмдүктөрдөн алынып, андан кийин 1% сахароза жана 0,3% геллан сагызын камтыган Gamborg B5 чөйрөсүнө (Fujifilm Wako Pure Chemical) капталып, 23°C температурада үзгүлтүксүз жарык астында инкубацияланган.
Тамекинин BY-2 клеткалары (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) С. Хасезава (Токио университети) тарабынан берилген. BY-2 клеткалары модификацияланган Линсмейер жана Скуг чөйрөсүндө 95 эсе суюлтулуп, жума сайын 2,4-дихлорфеноксиуксус кислотасы менен толукталган 32. Клетка суспензиясы айланма чайкоочу машинада караңгыда 27°C температурада 130 айн/мин ылдамдыкта аралаштырылган. Клеткаларды жаңы чөйрөнүн көлөмүнөн 10 эсе көп көлөмдөгү чөйрө менен жууп, ошол эле чөйрөдө кайра эритилген. Түстүү капуста мозаикалык вирусунун 35S промоторунун астында TagRFP-TUA6 микротүтүкчө маркерин же GFP-ABD2 актин жипче маркерин туруктуу экспрессиялаган BY-2 трансгендик клетка линиялары сүрөттөлгөндөй түзүлгөн33,34,35. Бул клетка линиялары баштапкы BY-2 клетка линиясы үчүн колдонулган процедураларга окшош процедураларды колдонуу менен сакталып жана синхрондоштурулушу мүмкүн.
HeLa клеткалары 37°C инкубатордо 5% CO2 кошулган 10% түйүлдүк уйдун сывороткасы, 1,2 U/мл пенициллин жана 1,2 мкг/мл стрептомицин кошулган Дульбекконун модификацияланган Eagle's чөйрөсүндө (DMEM) (Life Technologies) өстүрүлгөн.
Бул кол жазмада сүрөттөлгөн бардык эксперименттер Жапониянын биологиялык коопсуздук эрежелерине жана көрсөтмөлөрүнө ылайык жүргүзүлдү.
Кошулмалар диметилсульфоксидде (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) баштапкы эритмелер катары эритилип, Arabidopsis жана тамеки үчүн MS чөйрөсүндө же боор чөбү үчүн Gamborg B5 чөйрөсүндө суюлтулган. Тамырдын өсүшүн басаңдатуу анализи үчүн, көрсөтүлгөн кошулмаларды же DMSO камтыган агар чөйрөсүнө ар бир тарелкага 10дон ашык урук себилген. Уруктар өсүү камерасында 7 күн инкубацияланган. Көчөттөр сүрөткө тартылып, тамырлардын узундугу өлчөнгөн. Arabidopsis өнүп чыгуу анализи үчүн, ар бир тарелкага 48 урук 200 мкМ кошулманы же DMSO камтыган агар чөйрөсүнө себилген. Arabidopsis уруктары өсүү камерасында өстүрүлүп, өнүп чыккан көчөттөрдүн саны өнүп чыккандан 7 күн өткөндөн кийин эсептелген (dag). Тамекинин өнүп чыгуу анализи үчүн, ар бир тарелкага 24 урук 200 мкМ KAND же DMSO камтыган агар чөйрөсүнө себилген. Тамекинин уруктары өсүү камерасында өстүрүлүп, өнүп чыккан көчөттөрдүн саны 14 күндөн кийин эсептелген. Боордун өсүшүн басаңдатуу анализи үчүн ар бир пластинадан алынган 9 эмбрион көрсөтүлгөн концентрациядагы KAND же DMSO камтыган агар чөйрөсүнө салынып, өсүү камерасында 14 күн инкубацияланган.
Тамыр меристеманын уюшушун көрүү үчүн 5 мг/мл пропидий йодиди (PI) менен боёлгон көчөттөрдү колдонуңуз. PI сигналдары TCS SPE конфокалдык лазердик сканерлөөчү микроскоп (Leica Microsystems) аркылуу флуоресценциялык микроскопия аркылуу байкалган.
Тамырларды β-глюкуронидаза (GUS) менен гистохимиялык боёо Malami жана Benfey36 тарабынан сүрөттөлгөн протоколго ылайык жүргүзүлдү. Көчөттөр түнү бою 90% ацетонго фиксацияланып, GUS буфериндеги 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-глюкурон кислотасы менен 1 саат боёлуп, гидратталган хлордегид эритмесине (8 г хлоргидрат, 2 мл суу жана 1 мл глицерин) салынып, Axio Imager M1 микроскобу (Carl Zeiss) аркылуу дифференциалдык интерференциялык контрасттык микроскопия аркылуу байкалды.
Тамыр бурчтары тигинен жайгаштырылган тарелкаларда өстүрүлгөн 7 күндүк көчөттөрдө өлчөнгөн. 6-кадамда сүрөттөлгөндөй, тамырдын бурчун тартылуу векторунун багытына жараша өлчөңүз.
Кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн жайгашуусу сүрөттөлгөндөй байкалган, протоколго 37 бир аз өзгөртүүлөр киргизилген. Анти-β-тубулин антителосу (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) жана Alexa Fluor 488 менен конъюгацияланган чычканга каршы IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) тиешелүүлүгүнө жараша 1:1000 жана 1:100 суюлтууларда биринчилик жана экинчилик антителолор катары колдонулган. Флуоресценция сүрөттөрү TCS SPE конфокалдык лазердик сканерлөөчү микроскоп (Leica Microsystems) аркылуу алынган. Z-стек сүрөттөрүн алып, өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык максималдуу интенсивдүүлүк проекцияларын түзүңүз.
HeLa клеткаларынын көбөйүү анализи өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык Cell Counting Kit 8 (Dojindo) колдонулуп жүргүзүлдү.
E. coli DH5α өсүшү 600 нм (OD600) спектрофотометрди колдонуп, культурадагы клетка тыгыздыгын өлчөө менен талданды.
Трансгендик BY-2 клеткаларындагы цитоскелеттик уюм CSU-X1 конфокалдык сканерлөөчү түзүлүш (Yokogawa) жана sCMOS камерасы (Zyla, Andor Technology) менен жабдылган флуоресценциялык микроскоптун жардамы менен байкалган. Цитоскелеттик тыгыздык сүрөттү талдоо аркылуу бааланган, ал сүрөттөлгөндөй ImageJ программасын колдонуп, конфокалдык сүрөттөрдөгү цитоплазмалык пикселдердин арасындагы цитоскелеттик пикселдердин пайызын сандык жактан аныктаган38,39.
BY-2 клеткаларындагы клетка өлүмүн аныктоо үчүн, клетка суспензиясынын аликвотасы бөлмө температурасында 10 мүнөт бою 0,05% Эванс көк боёгу менен инкубацияланган. Өлгөн клеткаларды Эванс көк боёгу менен тандап боёо бүтүн плазма мембранасы менен тирүү клеткалардан боёктун экструзиясынан көз каранды40. Боёлгон клеткалар жарык талаалуу микроскоп (BX53, Olympus) аркылуу байкалган.
HeLa клеткалары 10% FBS кошулган DMEMде 37°C жана 5% CO2 температурада нымдалган инкубатордо өстүрүлдү. Клеткалар 37°C температурада 6 саат бою 100 мкМ KAND 11, кумамонам кислотасы 6, кумамонамид 1, 100 нг/мл колцемид (Gibco) же 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) менен иштетилди. Клеткалар бөлмө температурасында 10 мүнөт MetOH менен, андан кийин 5 мүнөт ацетат менен фиксацияланды. Фиксацияланган клеткалар 0,5% BSA/PBSте суюлтулган β-тубулиндин баштапкы антителосу (1D4A4, Proteintech: 66240-1) менен 2 саат бою инкубацияланды, TBST менен 3 жолу жуулду, андан кийин Alexa Fluor эчкинин антителосу менен инкубацияланды. 488 1 саат. – Чычкан IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) жана 0,5% BSA/PBS эритмесинде суюлтулган 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). TBST менен үч жолу жуугандан кийин, боёлгон клеткалар Nikon Eclipse Ti-E инверттелген микроскопунда байкалган. Сүрөттөр MetaMorph программасын (Molecular Devices) колдонуп, муздатылган Hamamatsu ORCA-R2 CCD камерасы менен тартылган.
Жарыяланган убактысы: 2024-жылдын 17-июну