Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз колдонуп жаткан браузердин версиясы чектелген CSS колдоосуна ээ.Мыкты натыйжаларга жетишүү үчүн, браузериңиздин жаңыраак версиясын колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Ошол эле учурда, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилдөөсүз же JavaScriptсиз көрсөтүп жатабыз.
Табигый азыктарды табуу жана пайдалуу колдонуу адамдын жашоосун жакшыртууга жардам берет.Өсүмдүктөрдүн өсүшүнө бөгөт коюучу химиялык заттар отоо чөптөрдү жок кылуу үчүн гербицид катары кеңири колдонулат.Гербициддердин ар кандай түрлөрүн колдонуу зарылдыгынан улам жаңы механизмдери бар кошулмаларды аныктоо зарылчылыгы келип чыкты.Бул изилдөөдө биз Streptomyces werraensis MK493-CF1ден N-алкоксипирролдук жаңы кошулманы, кумамонамидди таптык жана толук синтез процессин түздүк.Биологиялык активдүүлүктү анализдөө аркылуу биз урс-моноамин кислотасы урс-моноамиттин синтетикалык ортомчусу жана потенциалдууөсүмдүктөрдүн өсүү ингибитору.Мындан тышкары, биз HeLa клеткаларынын өсүшүнө терс таасирин тийгизбестен, жогорку гербициддик активдүүлүккө ээ urbenyloxy туунду (UDA), анын ичинде ар кандай урбенон кислотасынын туундуларын иштеп чыктык.Биз ошондой эле urmotonic кислота туундулары өсүмдүк microtubules бузуп деп табылган;Мындан тышкары, KAND актин жипчелерине таасир этет жана клетканын өлүмүнө түртөт;Бул көп кырдуу эффекттер белгилүү микротүтүкчөлөрдүн ингибиторлорунан айырмаланат жана жаңы гербициддерди иштеп чыгууда маанилүү артыкчылык болуп саналган урсон кислотасынын жаңы аракетинин механизмин сунуштайт.
Пайдалуу табигый продуктыларды жана алардын туундуларын табуу жана иш жүзүндө колдонуу адамдын жашоосунун сапатын жакшыртуунун каражаты болуп саналат.Микроорганизмдер, өсүмдүктөр жана курт-кумурскалар тарабынан өндүрүлгөн экинчилик метаболиттер медицинада жана айыл чарбасында чоң жетишкендиктерге алып келди.Табигый азыктардан көптөгөн антибиотиктер жана лейкозго каршы дарылар иштелип чыккан.Мындан тышкары, ар кандай түрлөрүпестициддер, айыл чарбасында колдонуу үчүн бул табигый продуктылардан фунгициддер жана гербициддер алынат.Атап айтканда, отоо чөптөрдү жок кылуучу гербициддер азыркы айыл чарбасында түшүмдүүлүктү жогорулатуунун маанилүү куралы болуп саналат жана ар кандай түрдөгү кошулмаларды коммерциялык максатта колдонууда.Өсүмдүктөрдөгү бир нече клеткалык процесстер, мисалы, фотосинтез, аминокислоталардын метаболизми, клетка дубалынын синтези, митоздун жөнгө салынышы, фитогормон сигнализациясы же белок синтези гербициддердин типтүү максаттары болуп эсептелет.Микротүтүкчөлөрдүн иштешине тоскоол болгон бирикмелер митоздук жөнгө салууга2 таасирин тийгизип, өсүмдүктөрдүн өсүшүнө таасир этүүчү гербициддердин кеңири таралган классы болуп саналат.
Микротүтүкчөлөр цитоскелеттин компоненттери болуп саналат жана эукариоттук клеткаларда кеңири сакталган.Тубулин гетеродимери α-тубулин жана β-тубулинден турат, сызыктуу микротүтүкчөлөрдүн протофиламенттерин түзүүчү, 13 протофиламент цилиндр формасындагы түзүлүштү түзөт.Микротүтүкчөлөр өсүмдүк клеткаларында бир нече ролду ойнойт, анын ичинде клетканын формасын, клетканын бөлүнүшүн жана клетка ичиндеги транспорт3,4 аныктоо.Өсүмдүк клеткаларында интерфазалык плазма мембранасынын астындагы микротүтүкчөлөр бар жана бул кортикалдык микротүтүкчөлөр целлюлоза синтаза комплекстерин жөнгө салуу аркылуу целлюлоза микрофибрилдерин уюштурууну көзөмөлдөйт деп эсептелет4,5.Тамыр учу тез узартуу зонасында болгон тамыр эпидермис клеткаларынын кортикалдык микротюбулалары капталдан жайгашат, ал эми целлюлоза микроталчалары бул микротүтүкчөлөрдү ээрчип, клетканын кеңейүү багытын чектеп, ошону менен клетканын анизотроптук узартылышын шарттайт.Демек, микротүтүкчөлөрдүн функциясы өсүмдүктөрдүн морфологиясы менен тыгыз байланышта.Тубулинди коддоочу гендердеги аминокислоталардын алмаштырылышы Арабидопсис 6,7де кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн кыйшаюусун жана сол же оң жактуу өсүшүн шарттайт.Ошо сыяктуу эле, микротүтүкчөлөрдүн динамикасын жөнгө салуучу микротүтүкчөлөр менен байланышкан протеиндердеги мутациялар да тамырдын бузулушуна алып келиши мүмкүн8,9,10,11,12,13.Мындан тышкары, претилахлор катары белгилүү болгон дисопирамид сыяктуу микротүтүкчөлөрдү бузуучу гербициддер менен дарылоо да сол жактуу кыйшык тамырдын өсүшүнө себеп болот14.Бул маалыматтар микротүтүкчөлөр функциясын так жөнгө салуу өсүмдүктөрдүн өсүү багытын аныктоо үчүн абдан маанилүү экенин көрсөтүп турат.
Микротүтүкчөлөрдүн ингибиторлорунун ар кандай түрлөрү табылган жана бул препараттар цитоскелеттик изилдөөлөргө, ошондой эле айыл чарбага жана медицинага чоң салым кошушкан2.Атап айтканда, оризалин, динитроанилин бирикмелери, дизопирамид, бензамид менен байланышкан бирикмелер жана алардын аналогдору микротүтүкчөлөрдүн иштешине тоскоол болот жана ошону менен өсүмдүктөрдүн өсүшүнө тоскоол болот.Ошондуктан алар гербицид катары кеңири колдонулат.Бирок, микротүтүкчөлөр өсүмдүктөрдүн жана жаныбарлардын клеткаларынын маанилүү компоненти болгондуктан, көпчүлүк микротүтүкчөлөрдүн ингибиторлору эки клетканын тең түрү үчүн цитотоксик болуп саналат.Ошондуктан, гербициддер катары таанылган пайдалуулугуна карабастан, практикалык максаттарда микротүтүкчөлөргө каршы агенттердин чектелген саны колдонулат.
Streptomyces - Streptomyces үй-бүлөсүнүн бир тукуму, ага аэробдук, грам-позитивдүү, жип сымал бактериялар кирет жана экинчилик метаболиттердин кеңири спектрин өндүрүү жөндөмү менен кеңири белгилүү.Ошондуктан, ал жаңы биологиялык активдүү табигый продуктулардын маанилүү булактарынын бири болуп эсептелет.Учурдагы изилдөөдө биз кумамонамид деп аталган жаңы кошулманы таптык, ал Streptomyces werraensis MK493-CF1 жана S. werraensis ISP 5486дан бөлүнүп алынган. Спектралдык анализди жана толук спектралдык анализди колдонуу менен кумамонамиддин структурасы мүнөздөлгөн жана анын уникалдуу N-алкоксипиррол скелети аныкталган. аныкталды.синтез.Ursmonoamide жана анын туундуларынын синтетикалык аралык продуктусу болгон урсмон кислотасы популярдуу арабидопсис thaliana моделинин өсүүсүн жана өнүшүн токтото тургандыгы аныкталган.Структура-иш-аракет мамилелерин изилдөөдө биз урсон кислотасынын (KAND) nonyloxy туундусу деп аталган урсон кислотасына өзгөртүлгөн C9 менен кошулма өсүү жана өнүп чыгууга бөгөт коюучу таасирин олуттуу түрдө күчөтөрүн таптык.Белгилей кетчү нерсе, жаңы ачылган өсүмдүктөрдүн өсүү ингибитору тамеки менен боордун өсүшүнө да таасирин тийгизген жана бактериялар же HeLa клеткалары үчүн цитотоксик эмес.Андан тышкары, кээ бир urmotonic кислота туундулары бузулган тамыр фенотипине түрткү, бул туундулар түз же кыйыр түрдө микротүтүкчөлөргө таасир этет.Бул идеяга ылайык, иммуногистохимиялык же флуоресценттүү протеиндер менен белгиленген микротүтүкчөлөргө болгон байкоолорубуз KAND менен дарылоо микротүтүкчөлөрдү деполимеризациялоону көрсөтүп турат.Мындан тышкары, кумамотоник кислотасынын туундулары менен дарылоо актин микрофиламенттерин бузган.Ошентип, биз аракеттин уникалдуу механизми цитоскелетти жок кылууну камтыган жаңы өсүмдүктөрдүн өсүү ингибиторун таптык.
MK493-CF1 штаммы Токиодогу Шинагава-куда топурактан бөлүнүп алынган.MK493-CF1 штаммы жакшы бутактанган стромдук мицелийди түздү.16S рибосомалык РНК генинин жарым-жартылай ырааттуулугу (1422 bp) аныкталган.Бул штамм S. werraensisге абдан окшош (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типтүү штамм, 99,93%).Бул натыйжанын негизинде бул штаммдын S. werraensis түрү штаммына тыгыз байланышы бар экендиги аныкталган.Ошондуктан, биз бул штаммды убактылуу S. werraensis MK493-CF1 деп атадык.S. werraensis ISP 5486T да ошол эле биоактивдүү кошулмаларды чыгарат.Бул микроорганизмден табигый продуктуларды алуу боюнча алгачкы изилдөөлөр аз болгондуктан, андан ары химиялык изилдөөлөр жүргүзүлдү.S. werraensis MK493-CF1 арпа чөйрөсүндө 30°С катуу абалдагы ачытуу жолу менен 14 күн бою өстүрүлгөндөн кийин, чөйрө 50% EtOH менен экстракцияланган.59,5 мг чийки экстракты алуу үчүн 60 мл үлгү кургатылган.Чийки экстракты N-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксамидди (1, кумамонамид деп аталган, 36,0 мг) берүү үчүн тескери фазалык HPLC дуушар болгон.1 жалпы суммасы чийки экстракты болжол менен 60% түзөт.Ошондуктан, биз кумамотоамид 1 касиеттерин майда-чүйдөсүнө чейин изилдөөнү чечтик.
Coumamonamide 1 ак аморфтук порошок жана жогорку чечим массалык спектрометрия (HRESIMS) C6H8N2O2 тастыктайт (сүрөт. 1).Бул кошулманын C2-алмаштырылган пиррол фрагменти δH 6.94 (1Н, т, J = 2.8, 4.8 Гц, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H ЯМР спектринде: 4.5 Гц) менен мүнөздөлөт. , H-5) жана δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Гц, H-6), жана 13C ЯМР спектри төрт sp2 көмүртек атомунун катышуусун көрсөтөт.C2 позициясында амид тобунун болушу δC 161.1 боюнча С-3 протонунан амиддик карбонил көмүртекине чейинки HMBC корреляциясы менен бааланган.Мындан тышкары, 1 H жана 13 C NMR чокулары δH 4.10 (3H, S) жана δC 68.3 молекулада N-метокси топторунун бар экенин көрсөтүп турат.Метокси топтун туура абалы, мисалы, күчөтүлгөн айырма спектроскопиясы жана ядролук Overhauser аббревиатурасы (NOEDF) сыяктуу спектроскопиялык анализдин жардамы менен аныктала элек болсо да, N-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксамид биринчи талапкер кошулма болуп калды.
1нин туура структурасын аныктоо үчүн жалпы синтез аткарылган (2а-сүрөт).Коммерциялык жеткиликтүү 2-аминопиридин 2 менен m-CPBA менен дарылоо сандык түшүм боюнча тиешелүү N-оксиди 3 алып келди.2 2-аминоазидациялангандан кийин Абрамович тарабынан сүрөттөлгөн циклоконденсациялоо реакциясы 90°С бензолдо жүргүзүлүп, граммда керектүү 1-гидрокси-1Н-пиррол-2-карбонитрил 5 алынган.Ылдамдыгы 60% (эки этап).15,16.4 methylation жана гидролиз, анда 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic кислотасы ( "cumotonic кислотасы" деп аталат, 6) жакшы түшүм (70%, эки кадам) берди.Акыр-аягы, суулуу аммиакты колдонуу менен кислота хлориди 6 аркылуу амидациялоо Кумамото амид 1 98% киреше берди.Синтезделген 1нин бардык спектрдик маалыматтары обочолонгон 1ге окшош болгон, ошондуктан 1дин структурасы аныкталган;
Урбенамид менен урбен кислотасынын жалпы синтези жана биологиялык активдүүлүгүнүн анализи.(а) Кумамото амидинин жалпы синтези.(б) Жети күндүк жапайы түрдөгү Arabidopsis Columbia (Кол) көчөттөрү көрсөтүлгөн концентрацияларда кумамонамид 6 же кумамонамид 1 камтыган Мурашиге жана Ског (MS) плиталарында өстүрүлгөн.Масштаб тилкеси = 1 см.
Биринчиден, биз урбенамиддин жана анын ортоңку заттарынын өсүмдүктөрдүн өсүшүн модуляциялоо жөндөмдүүлүгү үчүн биологиялык активдүүлүгүн бааладык.Биз MS агар чөйрөсүнө урсмонамид 1 же урсмон кислотасынын 6 ар кандай концентрациясын жана бул чөйрөдө культураланган Arabidopsis thaliana көчөттөрүн коштук.Бул анализдер 6дын жогорку концентрациясы (500 мкм) тамырдын өсүшүнө тоскоол болгонун көрсөттү (сүрөт 2б).Андан кийин, биз N1 6 позициясын алмаштыруу менен ар кандай туундуларды генерацияладык жана алар боюнча структура-аракет мамилелерин изилдөөнү жүргүздүк (аналогдук синтез процесси Кошумча маалыматта (СИ) сүрөттөлөт).Arabidopsis көчөттөрү 50 мкм урсон кислотасынын туундусун камтыган чөйрөдө өстүрүлүп, тамырдын узундугу өлчөнгөн.сүрөттө көрсөтүлгөндөй.3a, b жана S1 сүрөттөрүндө көрсөтүлгөндөй, кумамо кислоталары N1 абалында сызыктуу алкокси чынжырларынын (9, 10, 11, 12 жана 13) же чоң алкокси чынжырларынын (15, 16 жана 17) ар кандай узундугуна ээ.Туундулар тамырдын өсүшүнө олуттуу бөгөт койгон.Мындан тышкары, биз 200 μM 10, 11 же 17 колдонуу өнүп чыгууга тоскоол экенин байкадык (сүрөт. 3c жана S2).
Кумамото амидинин жана ага байланыштуу кошулмалардын структуралык активдүүлүгүн изилдөө.(а) Аналогдордун структурасы жана синтез схемасы.(б) MS чөйрөсүндө 50 мкм кумамонамид туундулары бар же аларсыз өстүрүлгөн 7 күндүк көчөттөрдүн тамыр узундугунун сандык көрсөткүчү.Жылдызчалар жасалма мамиле менен олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат (t-тест, б< 0,05).н>18. Маалыматтар орточо ± SD катары көрсөтүлөт.nt "сыналбаган" дегенди билдирет, анткени уруктардын 50% ашыгы өнүп чыккан эмес.(c) MS чөйрөсүндө 7 күн бою 200 мкм кумамонамид жана ага тиешелүү кошулмаларсыз инкубацияланган дарыланган үрөндөрдүн өнүү ылдамдыгынын сандык көрсөткүчү.Жылдызчалар жасалма дарылоо (хи-квадрат тест) менен олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат.n=96.
Кызыктуусу, C9 караганда узунураак алкил каптал чынжырларынын кошулушу ингибитордук активдүүлүктү азайтып, кумамотой кислотасы менен байланышкан кошулмалар биологиялык активдүүлүгүн көрсөтүү үчүн белгилүү бир өлчөмдөгү каптал чынжырларды талап кылат деген ойдо.
Түзүмдүк активдүүлүк мамилелеринин анализи C9 урсон кислотасына өзгөртүлгөнүн жана урсон кислотасынын нонилокси туундусу (мындан ары KAND 11 деп аталат) өсүмдүктөрдүн өсүшүнүн эң эффективдүү ингибитору болгонун көрсөткөндүктөн, биз KAND 11дин кеңири мүнөздөмөсүн жүргүздүк. Арабидопсисти дарылоо менен 50 мкм KAND 11 өнүп чыгууну дээрлик толугу менен алдын алган, ал эми KAND 11дин төмөнкү концентрациялары (40, 30, 20 же 10 мкм) дозага көз каранды болгон тамырдын өсүшүнө тоскоол болгон (сүрөт 4a, b).KAND 11 тамырдын меристемасынын жашоо жөндөмдүүлүгүнө таасирин тийгизерин текшерүү үчүн, биз пропидий йодид (PI) менен боёлгон тамыр меристемаларын изилдеп, меристеманын аянтынын өлчөмүн өлчөдүк.25 мкм КАНД-11 камтыган чөйрөдө өстүрүлгөн көчөттөрдүн меристемасынын өлчөмү 151,1 ± 32,5 мкм, ал эми DMSO камтыган контролдук чөйрөдө өстүрүлгөн көчөттөрдүн меристемасынын өлчөмү 264,7 ± 30,8 мкм болгон (сүр. 4c, d) , бул KAND-11 клеткалык активдүүлүктү калыбына келтирерин көрсөтүп турат.жайылтуу.Тамыр меристемасы.Ушуга ылайык, KAND 11 дарылоо клетка бөлүнүү маркер CDKB2 көлөмүн кыскарган; 1p :: CDKB2; 1-GUS сигнал тамыры меристема (сүрөт. 4e) 17.Бул жыйынтыктар KAND 11 клетканын пролиферация активдүүлүгүн азайтуу аркылуу тамырдын өсүшүнө тоскоол экенин көрсөтүп турат.
Урбенон кислотасынын туундуларынын (урбенилокси туундуларынын) өсүү боюнча ингибитордук таасиринин анализи.(а) КАНД 11 көрсөтүлгөн концентрациялары бар MS плиталарында өстүрүлгөн 7 күндүк жапайы түрдөгү Col көчөттөрү. Масштаб тилкеси = 1 см.(б) Тамырдын узундугун сандык эсептөө.Каттар олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат (Tukey HSD тести, б< 0,05).н>16. Маалыматтар орточо ± SD катары көрсөтүлөт.(c) MS пластинкаларында өстүрүлгөн пропидий йодид менен боёлгон жапайы типтеги Col тамырларынын конфокалдык микроскопиясы 25 мкМ KAND 11. Ак кашаалар тамыр меристемасын көрсөтөт.Масштаб тилкеси = 100 мкм.(г) Тамыр меристемасынын өлчөмүн аныктоо (n = 10дон 11ге чейин).Статистикалык айырмачылыктар t-тесттин жардамы менен аныкталган (б< 0,05).Барлар меристеманын орточо өлчөмүн билдирет.(e) CDKB2 конструкциясын камтыган тамыр меристемасынын дифференциалдык интерференциялык контраст (DIC) микроскопиясы;1pro: CDKB2;1-GUS боёлуп, 25 μM KAND анализи бар же жок MS плиталарында өстүрүлгөн 5 күндүк көчөттөр боюнча боёлгон.
KAND 11дин фитотоксиктиги дагы бир эки үлүштүү өсүмдүк, тамеки (Nicotiana tabacum) жана негизги кургактыктагы өсүмдүк модели организм, боор курт (Marchantia polymorpha) аркылуу дагы текшерилген.Арабидопсис сыяктуу эле, 25 мкм KAND 11 камтыган чөйрөдө өстүрүлгөн тамекинин SR-1 көчөттөрү кыскараак тамырларды пайда кылган (5а-сүрөт).Кошумчалай кетсек, 48 үрөндүн 40ы 200 мкМ КАНД 11 камтыган пластиналарда өнүп чыккан, ал эми 48 үрөндүн баары жасалма иштетилген чөйрөдө өнүп чыккан, бул KANDдын жогорку концентрациясы олуттуу болгонун көрсөтүп турат (б.< 0.05;чи тест -квадрат) тамекинин өнүп чыгышына тоскоол болгон.(5б-сүрөт).Мындан тышкары, боор куртундагы бактериялардын өсүшүнө тоскоол болгон KAND 11 концентрациясы Арабидопсистеги эффективдүү концентрацияга окшош болгон (сүрөт 5c).Бул натыйжалар KAND 11 ар кандай өсүмдүктөрдүн өсүшүнө тоскоол боло аларын көрсөтүп турат.Андан кийин биз, тиешелүүлүгүнө жараша, жогорку жаныбарлардын жана бактериялык клеткалардын өкүлдөрү катары башка организмдер, атап айтканда, адамдын HeLa клеткалары жана Escherichia coli штаммы DH5α аюу моноамид менен байланышкан бирикмелердин мүмкүн cytotoxicity изилдеп.Клетка пролиферациясынын бир катар анализдеринде биз coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6 жана KAND 11 100 мкм концентрацияда HeLa же E. coli клеткаларынын өсүшүнө таасир этпегендигин байкадык (сүрөт 5d, e).
Арабидопсис эмес организмдерде KAND 11дин өсүшүнө бөгөт коюу.(а) Эки жумалык жапайы SR-1 тамекинин көчөттөрү вертикалдуу жайгаштырылган MS пластинкаларында 25 мкм KAND 11 камтыган. (б) Эки жумалык жапайы SR-1 тамекинин көчөттөрү горизонталдуу жайгаштырылган жерде өстүрүлгөн. 200 мкм KAND 11 камтыган MS плиталары. (c) Gamborg B5 пластинкаларында өстүрүлгөн эки жумалык жапайы тибиндеги Tak-1 боор куртунун бүчүрлөрү KAND 11дин көрсөтүлгөн концентрациялары менен. Кызыл жебелер эки жумалык инкубациянын ичинде өсүүсүн токтоткон спораларды көрсөтүп турат. мезгил.(г) HeLa клеткаларынын клетка пролиферациясын талдоо.Жашоого жөндөмдүү клеткалардын саны клеткаларды эсептөө комплекти 8 (Дожиндо) аркылуу белгиленген убакыт аралыгы менен өлчөнгөн.Контрол катары HeLa клеткалары 5 мкг/мл актиномицин D (Акт D) менен дарыланган, ал РНК полимераза транскрипциясын бөгөттөп, клетканын өлүмүнө алып келет.Анализдер үч нускада жүргүзүлдү.(д) E. coli клеткаларынын пролиферациясын талдоо.E. coli өсүшү OD600 өлчөө менен талдоого алынган.Көзөмөл катары клеткалар 50 мкг/мл ампициллин (Amp) менен дарыланган, ал бактериялык клетка дубалынын синтезин бөгөттөйт.Анализдер үч нускада жүргүзүлдү.
Урамидге байланыштуу кошулмалардан келип чыккан цитотоксиктиктин иш-аракетинин механизмин чечмелөө үчүн биз орточо ингибитордук таасири бар урбен кислотасынын туундуларын кайра талдадык.сүрөттө көрсөтүлгөндөй.2b, 6a сүрөттөрүндө көрсөтүлгөндөй, урмотоник кислотасынын жогорку концентрациясын (200 мкм) камтыган агар пластинкаларында өстүрүлгөн көчөттөр 6 кыска жана сол жак ийри тамырларды (θ = – 23,7 ± 6,1), ал эми контролдук чөйрөдө өстүрүлгөн көчөттөрдү көчөттөр дээрлик түз тамырларды берген (θ = – 3,8 ± 7,1).Бул мүнөздүү кыйгач өсүш кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн дисфункциясынан келип чыккандыгы белгилүү.Бул табылгага ылайык, микротүтүкчөлөрдү туруксуздаштыруучу дары-дармектер дизопирамид жана оризалин биздин өсүү шарттарында тамырдын кыйшаюусун жаратты (сүрөт. 2b, 6a).Ошол эле учурда биз урмотоник кислотанын туундуларын сынап көрдүк жана алардын айрым концентрацияларында кыйгач тамырдын өсүшүнө алып келген бир нечесин тандап алдык.8, 9 жана 15 кошулмалар тиешелүүлүгүнө жараша 75 μM, 50 μM жана 40 μM тамырдын өсүү багытын өзгөрттү, бул бул кошулмалар микротүтүкчөлөрдү эффективдүү дестабилдештире аларын көрсөтүүдө (сүрөт 2b, 6a).Биз ошондой эле эң күчтүү урсол кислотасынын туундусун, KAND 11ди азыраак концентрацияда (15 мкМ) сынап көрдүк жана KAND 11ди колдонуу тамырдын өсүшүнө тоскоол болорун жана тамырдын өсүү багыты тегиз эмес экенин, бирок алар солго эңкейишке умтулган ( Сүрөт C3)..Микротүтүкчөлөрдү туруксуздаштыруучу дарылардын жогорку концентрациясы кээде тамырдын кыйшаюусуна себеп болбостон, өсүмдүктөрдүн өсүшүнө тоскоол болгондуктан, биз кийинчерээк KAND 11 тамыр эпидермис клеткаларындагы кортикалдык микротүтүкчөлөргө байкоо жүргүзүү аркылуу микротүтүкчөлөргө таасир этет дегенге баа бердик.25 μM KAND 11 менен дарыланган көчөт тамырларынын эпидермис клеткаларында анти-β-тубулин антителолорунун жардамы менен иммуногистохимиясы узартуу зонасында эпидермис клеткаларында дээрлик бардык кортикалдык микротюбулалардын жок болгонун көрсөттү (сүрөт 6б).Бул натыйжалар кумамотоник кислотасы жана анын туундулары микротүтүкчөлөргө түздөн-түз же кыйыр түрдө таасир этип, аларды бузуп, бул кошулмалар жаңы микротүтүкчөлөрдүн ингибиторлору экенин көрсөтүп турат.
Урсон кислотасы жана анын туундулары Arabidopsis thalianaдагы кортикалдык микротүтүкчөлөрдү өзгөртөт.(a) Көрсөтүлгөн концентрацияларда ар кандай урмотоник кислотасынын туундуларынын катышуусунда өлчөнгөн тамырдын жантайыш бурчу.Микротүтүкчөлөрдү тоскоол кылган эки кошулмалардын таасири: дизопирамид жана оризалин да талданды.Кыстарма тамырдын өсүү бурчун өлчөө үчүн колдонулган стандартты көрсөтөт.Жылдызчалар жасалма мамиле менен олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат (t-тест, б< 0,05).н>19. Масштаб тилкеси = 1 см.б) созулган зонасында эпидермис клеткаларындагы кортикалдык микротүтүкчөлөр.25 μM KAND 11 бар же жок MS пластинкаларында өстүрүлгөн жапайы түрдөгү Arabidopsis Col тамырларындагы микротүтүкчөлөр β-тубулиндик негизги антителолорду жана Alexa Fluor менен конъюгацияланган экинчилик антителолорду колдонуу менен иммуногистохимиялык боёо аркылуу көрүндү.Масштаб тилкеси = 10 мкм.в) Тамыр меристемасындагы микротүтүкчөлөрдүн митоздук түзүлүшү.Микротүтүкчөлөр иммуногистохимиялык боёктун жардамы менен көрүлгөн.Митоздук структуралар, анын ичинде профаза зоналары, шпиндельдер жана фрагмопластар конфокалдык сүрөттөрдөн саналган.Жебелер митоздук микротүтүкчөлөрдүн түзүлүштөрүн көрсөтөт.Жылдызчалар жасалма мамиле менен олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат (t-тест, б< 0,05).н>9. Масштаб тилкеси = 50 мкм.
Урса микротүтүкчөлөрдүн функциясын бузууга жөндөмдүү болсо да, анын иш-аракет механизми типтүү микротүтүкчөлөрдү деполимеризациялоочу агенттерден айырмаланат деп күтүлүүдө.Мисалы, дисопирамид жана оризалин сыяктуу микротүтүкчөлөрдү деполимеризациялоочу агенттердин жогорку концентрациясы эпидермис клеткаларынын анизотроптук кеңейүүсүнө түрткү берет, ал эми KAND 11 андай эмес.Мындан тышкары, KAND 11 менен дисопирамидди биргелешип колдонуу дизопирамид менен шартталган тамырдын өсүшүнө жооп кайтарды жана KAND 11 менен шартталган өсүштүн бөгөт коюусу байкалды (сүрөт S4).Биз ошондой эле гиперсезгич disopyramide 1-1 (phs1-1) мутанттын KAND 11ге жообун талдап чыктык. phs1-1 канондук эмес тубулинкиназа чекити мутациясына ээ жана дисопирамид9,20 менен мамиле кылганда кыскараак тамырларды пайда кылат.KAND 11 камтыган агар чөйрөсүндө өстүрүлгөн phs1-1 мутант көчөттөрү дисопирамидада өстүрүлгөндөргө окшош кыскараак тамырларга ээ болгон (сүрөт S5).
Мындан тышкары, биз KAND 11 менен дарыланган көчөттөрдүн тамыр меристемасында профаза зоналары, шпиндельдер жана фрагмопластар сыяктуу митоздук микротүтүкчөлөрдүн структураларын байкадык. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS үчүн байкоолорго ылайык, олуттуу төмөндөө митоздук микротүтүкчөлөрдүн саны байкалган (сүрөт .6c).
КАНД 11нин цитотоксиктигин субклеткалык чечүүдө мүнөздөш үчүн биз тамекинин BY-2 суспензия клеткаларын KAND 11 менен дарылап, алардын реакциясын байкадык.Биз алгач KAND 11ди BY-2 клеткаларына Fluorescently микротүтүкчөлөрдү белгилөөчү TagRFP-TUA6 экспрессиясына коштук.Кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн тыгыздыгы цитоплазмалык пикселдердин арасында цитоскелеттик пикселдердин пайызын сандык түрдө аныктаган сүрөт анализинин жардамы менен бааланган.Анализдин натыйжалары көрсөткөндөй, 1 саат бою 50 μM же 100 μM KAND 11 менен дарылоодон кийин тыгыздык тиешелүүлүгүнө жараша 0,94 ± 0,74% же 0,23 ± 0,28% га чейин азайган, ал эми DMSO менен мамиле кылынган клеткалардын тыгыздыгы ± 10,31 түзгөн. % (7а-сүрөт).Бул натыйжалар KAND 11 дарылоо кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн деполимеризациясын пайда кылган Арабидопсисте байкоого ылайык келет (сүрөт 6б).Биз ошондой эле BY-2 линиясын GFP-ABD-белгиленген актин жипчелери менен KAND 11дин бирдей концентрациясы менен дарылоодон кийин карап чыктык жана KAND 11 менен дарылоо актин жиптерин бузганын байкадык.50 мкм же 100 мкМ KAND 11 менен дарылоо 1 саат үчүн актин жипчесинин тыгыздыгын 1,20 ± 0,62% же 0,61 ± 0,26% га чейин кыскартты, ал эми DMSO менен мамиле кылган клеткалардагы тыгыздык 1,69 ± 0,51% болгон.7b).Бул натыйжалар актин жиптерине таасир этпеген пропизамиддин жана микротүтүкчөлөргө таасир этпеген актин деполимеризатору болгон латрункулиндин таасиринен айырмаланат (SI Figure S6).Мындан тышкары, кумамонамид 1, кумамонамид кислотасы 6 же KAND 11 менен дарылоо HeLa клеткаларындагы микротүтүкчөлөргө таасир эткен эмес (SI Figure S7).Ошентип, KAND 11 иш-аракет механизми белгилүү цитоскелет бузуучулардан айырмаланат деп эсептелет.Мындан тышкары, KAND 11 менен дарыланган BY-2 клеткаларына биздин микроскопиялык байкообуз KAND 11 менен дарылоо учурунда клетканын өлүмүнүн башталышын аныктады жана Эванс көк түскө боёлгон өлгөн клеткалардын үлүшү KAND 11 менен дарылоодон 30 мүнөт өткөндөн кийин олуттуу өспөгөнүн көрсөттү. 50 мкм же 100 мкм КАНД менен 90 мүнөттүк дарылоодон кийин өлгөн клеткалардын саны тиешелүүлүгүнө жараша 43,7% же 80,1% га чейин көбөйгөн (сүрөт 7c).Чогуу алынган бул маалыматтар ursolic кислотасынын жаңы туундусу KAND 11 иш-аракетинин мурда белгисиз механизми менен өсүмдүккө мүнөздүү цитоскелет ингибитору экенин көрсөтүп турат.
KAND кортикалдык микротүтүкчөлөргө, актин жиптерине жана тамекинин BY-2 клеткаларынын жашоо жөндөмдүүлүгүнө таасир этет.(а) TagRFP-TUA6 катышуусунда BY-2 клеткаларындагы кортикалдык микротюбулалардын визуализациясы.KAND 11 (50 мкм же 100 мкм) же DMSO менен дарыланган BY-2 клеткалары конфокалдык микроскопия менен изилденген.Кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн тыгыздыгы 25 көз карандысыз клетканын микросүрөттөрүнөн эсептелген.Каттар олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат (Tukey HSD тести, б< 0,05).Масштаб тилкеси = 10 мкм.(б) GFP-ABD2 катышуусунда визуализацияланган BY-2 клеткаларындагы кортикалдык актин жипчелери.KAND 11 (50 мкм же 100 мкм) же DMSO менен дарыланган BY-2 клеткалары конфокалдык микроскопия менен изилденген.Кортикалдык актин жипчелеринин тыгыздыгы 25 көз карандысыз клетканын микросүрөттөрүнөн эсептелген.Каттар олуттуу айырмачылыктарды көрсөтүп турат (Tukey HSD тести, б< 0,05).Масштаб тилкеси = 10 мкм.(c) Эванс көк боёо менен өлгөн BY-2 клеткаларын байкоо.KAND 11 (50 μM же 100 μM) же DMSO менен дарыланган BY-2 клеткалары жаркыраган талаа микроскопиясы менен изилденген.n=3.Масштаб тилкеси = 100 мкм.
Табигый жаңы продуктулардын ачылышы жана колдонулушу адам жашоосунун ар кандай аспектилеринде, анын ичинде медицинада жана айыл чарбасында олуттуу ийгиликтерге алып келди.Жаратылыш ресурстарынан пайдалуу кошулмаларды алуу боюнча тарыхый изилдөөлөр жүргүзүлдү.Атап айтканда, actinomycetes улам, мисалы, avermectin, ivermectin жана bleomycin коргошун кошулмасы жана анын туундулары, бир anticancer agent21,22 дары катары колдонулган ар кандай орто метаболиттерди өндүрүү үчүн жөндөмдүүлүгү менен нематоддор үчүн антипаразиттик антибиотиктер катары пайдалуу экендиги белгилүү.Ошо сыяктуу эле, актиномицеттерден ар кандай гербициддик кошулмалар табылган, алардын айрымдары коммерциялык максатта колдонулуп келет1,23.Ошондуктан, керектүү биологиялык активдүүлүгү бар табигый продуктуларды бөлүп алуу үчүн актиномицеттердин метаболиттерин талдоо натыйжалуу стратегия болуп эсептелет.Бул изилдөөдө биз S. werraensisден кумамонамид деген жаңы кошулманы таап, аны ийгиликтүү синтездедик.Урсон кислотасы урбенамиддин жана анын туундуларынын синтетикалык аралыгы.Ал мүнөздүү тамырдын тармалдашына алып келиши мүмкүн, орточо жана күчтүү гербициддик активдүүлүктү көрсөтөт жана өсүмдүк микротүтүкчөлөрүн түз же кыйыр түрдө жабыркатышы мүмкүн.Бирок, urmotonic кислотасынын иш-аракет механизми учурдагы микротүтүкчөлөр ингибиторлорунан айырмаланышы мүмкүн, анткени KAND 11 ошондой эле актин жиптерин бузуп, клетканын өлүмүнө алып келет, бул urmotonic кислотасы жана анын туундулары цитоскелет структураларынын кеңири спектрине таасир этүүчү жөнгө салуучу механизмди сунуштайт..
Урбенон кислотасынын андан ары деталдуу мүнөздөмөсү урбенон кислотасынын аракетинин механизмин жакшыраак түшүнүүгө жардам берет.Атап айтканда, кийинки максат урсон кислотасы жана анын туундулары микротүтүкчөлөргө тикелей таасир этеби жана аларды деполимеризациялайбы, же алардын аракети микротүтүкчөлөрдүн туруксуздугуна алып келер-келбесин аныктоо үчүн урсон кислотасынын кыскарган микротүтүкчөлөр менен байланышуу жөндөмдүүлүгүн баалоо болуп саналат.Мындан тышкары, микротүтүкчөлөр түздөн-түз бутага болбогон учурда, урсон кислотасынын өсүмдүк клеткаларына таасир этүүчү жерин жана молекулярдык максаттарын аныктоо, тиешелүү кошулмалардын касиеттерин жана гербициддик активдүүлүктү жакшыртуунун мүмкүн болгон жолдорун андан ары түшүнүүгө жардам берет.Биздин биоактивдүүлүк анализибиз E. coli да, HeLa клеткалары да таасир эткен эмес, ал эми Арабидопсис thaliana, тамеки жана боор курт сыяктуу өсүмдүктөрдүн өсүшүнө урсон кислотасынын уникалдуу цитотоксиктүү жөндөмүн көрсөттү.Жаныбарлардын клеткалары үчүн уулуулугу аз же такыр жок, урсон кислотасынын туундуларынын артыкчылыгы, эгерде алар ачык айыл чарба талааларында колдонуу үчүн гербициддер катары иштелип чыккан.Чынында эле, микротүтүкчөлөр эукариоттордо кеңири таралган структуралар болгондуктан, алардын өсүмдүктөрдө тандалма ингибициясы гербициддердин негизги талабы болуп саналат.Мисалы, пропизамид, микротүтүкчөлөр деполимеризациялоочу агент, тубулин менен түздөн-түз байланышып, полимеризацияны бөгөттөп, жаныбарлардын клеткаларына аз уулуу болгондуктан гербицид катары колдонулат24.Дизопирамидден айырмаланып, тиешелүү бензамиддер ар кандай максаттуу өзгөчөлүктөргө ээ.Өсүмдүк микротүтүкчөлөрүнөн тышкары, RH-4032 же бензоксамид, ошондой эле, тиешелүүлүгүнө жараша, жаныбарлардын клеткаларынын же oomycetes микротүтүкчөлөрүн ингибирлейт жана zalilamide аз phytotoxicity25,26,27 үчүн fungicide катары колдонулат.Жаңы ачылган аюу жана анын туундулары өсүмдүктөргө каршы тандалма цитотоксиктүүлүгүн көрсөтүшөт, бирок мындан аркы модификациялар алардын максаттуу өзгөчөлүгүн өзгөртүп, патогендик козу карындарга же омицеттерге каршы күрөшүү үчүн кошумча туундуларды камсыз кылаарын белгилей кетүү керек.
Урбенон кислотасынын жана анын туундуларынын уникалдуу касиеттери аларды гербицид катары иштеп чыгуу жана изилдөө куралдары катары колдонуу үчүн пайдалуу.Өсүмдүк клеткасынын формасын көзөмөлдөөдө цитоскелеттин мааниси кеңири таанылган.Мурунку изилдөөлөр өсүмдүктөрдүн морфогенезди туура көзөмөлдөө үчүн микротүтүкчөлөрдүн динамикасын көзөмөлдөө аркылуу кортикалдык микротүтүкчөлөрдү уюштуруунун татаал механизмдерин иштеп чыккандыгын көрсөттү.Микротүтүкчөлөрдүн активдүүлүгүн жөнгө салуу үчүн жооптуу көп сандагы молекулалар аныкталган жана ага байланыштуу изилдөөлөр дагы эле уланууда3,4,28.Өсүмдүк клеткаларындагы микротүтүкчөлөрдүн динамикасы жөнүндөгү биздин азыркы түшүнүгүбүз кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн түзүлүш механизмдерин толук түшүндүрө албайт.Мисалы, дизопирамид да, оризалин да микротүтүкчөлөрдү деполимеризациялай алса да, дизопирамид тамырдын катуу бурмаланышына алып келет, ал эми оризалин салыштырмалуу жумшак таасир этет.Мындан тышкары, микротүтүкчөлөрдү турукташтыруучу тубулиндеги мутациялар да тамырларда декстроротацияны пайда кылат, ал эми микротүтүкчөлөрдүн динамикасын турукташтыруучу паклитакселде андай эмес.Ошондуктан, ursolic кислотасынын молекулярдык максаттарын изилдөө жана аныктоо өсүмдүктөрдүн кортикалдык микротүтүкчөлөрүн жөнгө салуу боюнча жаңы түшүнүктөрдү бериши керек.Ошо сыяктуу эле, дисопирамид сыяктуу бурмаланган өсүштү стимулдаштырууда эффективдүү химиялык заттарды жана оризалин же кумамотор кислотасы сыяктуу эффективдүү эмес химиялык заттарды келечектеги салыштыруу бурмаланган өсүштүн кантип пайда болоорун көрсөтөт.
Башка жагынан алганда, коргонуу менен байланышкан cytoskeletal кайра түзүү урсон кислотасынын cytotoxicity түшүндүрүү үчүн дагы бир мүмкүнчүлүк болуп саналат.Өсүмдүк клеткаларына патогендин инфекциясы же элиситордун кириши кээде цитоскелеттин бузулушуна жана андан кийин клетканын өлүмүнө алып келет29.Мисалы, oomycete алынган криптоксантин тамеки клеткасы өлгөнгө чейин микротүтүкчөлөрдү жана актин жиптерин бузуп, KAND менен дарылоо30,31 менен болгон окуяга окшош.Урсон кислотасы менен шартталган коргонуу реакциялары менен уюлдук жооптордун ортосундагы окшоштуктар бизди алар жалпы клеткалык процесстерди козгойт деген гипотезага алып келди, бирок урсон кислотасынын криптоксантинге караганда тезирээк жана күчтүү таасири көрүнүп турат.Бирок, изилдөөлөр көрсөткөндөй, актин жипчелеринин бузулушу клетканын өзүнөн өзү өлүмүнө өбөлгө түзөт, бул дайыма эле микротүтүкчөлөрдүн бузулушу менен коштолбойт29.Мындан тышкары, урсон кислотасынын туундулары сыяктуу эле, патоген же элиситор тамырдын бузулушуна себеп болобу, көрүш керек.Ошентип, коргонуу жооптору менен цитоскелетти байланыштырган молекулярдык билим чече турган жагымдуу маселе.Урсон кислотасы менен байланышкан төмөнкү молекулярдык кошулмалардын, ошондой эле ар кандай потенциалдуу бир катар туундулардын болушун пайдалануу менен, алар белгисиз клеткалык механизмдерди максаттуу мүмкүнчүлүктөрдү камсыз кылышы мүмкүн.
Чогуу алганда, микротүтүкчөлөрдүн динамикасын модуляциялаган жаңы кошулмалардын ачылышы жана колдонулушу өсүмдүк клеткасынын формасын аныктоонун негизинде жаткан татаал молекулярдык механизмдерди чечүү үчүн күчтүү ыкмаларды берет.Бул контекстте, микротүтүкчөлөргө жана актин жипчелерине таасир этүүчү жана клетканын өлүмүнө себепкер болгон жакында иштелип чыккан урмотоник кислотасы микротүтүкчөлөрдү башкаруу менен бул башка механизмдердин ортосундагы байланышты чечмелөө мүмкүнчүлүгүн бериши мүмкүн.Ошентип, урбенон кислотасын колдонуу менен химиялык жана биологиялык талдоо бизге өсүмдүк цитоскелет башкаруу молекулярдык жөнгө салуу механизмдерин түшүнүүгө жардам берет.
S. werraensis MK493-CF1ди 2% (сал/көлөм) галактозадан, 2% (сал/көлөм) Essence пастасы, 1% (сал/көлөм) Бакто курамынан турган 110 мл үрөн чөйрөсү камтыган 500 мл эрленбей турган колбага сайыңыз .-сойтон (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) жүгөрү экстракты (KOGOSTCH Co., Ltd., Япония), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 жана 0,2% CaCO3 деионизацияланган сууда.(стерилизацияга чейин pH 7,4).Үрөн культуралары айланма чайкагычта (180 айн/мин) 27°C температурада 2 күн инкубацияланды.Катуу абалдагы ачытуу жолу менен өндүрүш.Үрөн маданияты (7 мл) 15 г пресстелген арпадан (MUSO Co., Ltd., Япония) жана 25 г деионизацияланган суудан (рН жөнгө салынбаган) турган 40 г өндүрүш чөйрөсүн камтыган 500 мл К-1 колбасына которулду. стерилизациядан мурун).).Ачытуу 14 күн бою караңгы жерде 30 ° C температурада жүргүзүлдү.Ачытуу материалы 40 мл/бөтөлкө EtOH менен алынып, центрифугаланган (1500 г, 4°С, 10 мин).Маданияттын үстүнкү заты (60 мл) 10% MeOH/EtOAc аралашмасы менен алынган.Органикалык катмар калдыкты (59,5 мг) алуу үчүн кыскартылган басым астында бууланды, ал HPLC градиенттүү элюциясы менен (0–10 мүнөт: 90%) тескери фаза тилкесинде (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID) дуушар болгон. 10 мм × узундугу 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 мүнөт: 90% H2O/CH3CN – 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 мүнөт: 90% H2O/EtOH, 45–155 мүнөт: 90% H2O / EtOH 100% EtOH (градиент (градиент), 155-200 мин: 100% EtOH) агымы 1,5 мл/мин ылдамдыгы боюнча, coumamonamide (1, 36,0 мг) ак аморфтук порошок катары бөлүнүп алынган.
Кумамотоамид(1);1Н-ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Гц, 1Н), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Гц 1Н), 6.05 (t, J = 3.8 Гц, 1Н).), 4,08 (с, 3Н);13C-NMR (125 МГц, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ эсептелген мааниси: 141,0659, өлчөнгөн мааниси: 141,0663, IR νмакс 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 113 см.
Колумбиянын уруктары (Кол-0) изилдөө колдонууга уруксаты менен Arabidopsis биологиялык ресурстук борборунан (ABRC) алынган.Кол-0 уруктары биздин лабораториялык шарттарда көбөйтүлүп, багылып, жапайы түрдөгү арабидопсис өсүмдүктөрү катары колдонулган.Арабидопсис уруктары үстүнкү стерилизацияланган жана 2% сахароза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-морфолино)этансульфон кислотасы (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) камтыган жарым күчтүү Мурашиге жана Ског чөйрөсүндө өстүрүлгөн. ).) жана 1,5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C жана туруктуу жарыкта.Phs1-1 мутантынын үрөнүн Т.Хашимото (Нара илим жана технология институту) берген.
SR-1 штаммынын үрөнүн Т.Хашимото (Нара илим жана технология институту) камсыздап, жапайы түрдөгү тамеки өсүмдүктөрү катары пайдаланылган.Тамекинин уруктары үстүнкү стерилизацияланган жана өнүп чыгуусун камсыз кылуу үчүн үч түн бою стерилдүү сууга чыланган, андан кийин 2% сахароза, 0,05% (салм/көлөм) MES жана 0,8% геллан сагызын (Fujifilm Wako Pure Chemical) камтыган жарым күчтүү эритмеге салынган. Мурашиге.жана Skoog чөйрөсү) рН 5,7 менен жана 23°С туруктуу жарыкта инкубацияланат.
Так-1 штаммы Т. Кохчи (Киото университети) тарабынан берилген жана боор курттарын изилдөө үчүн стандарттык эксперименттик бирдик катары колдонулган.Гемма стерилизацияланган өстүрүлгөн өсүмдүктөрдөн алынган жана андан кийин 1% сахароза жана 0,3% геллан сагыз камтыган Gamborg B5 чөйрөсүнө (Fujifilm Wako Pure Chemical) капталган жана 23°C үзгүлтүксүз жарык астында инкубацияланган.
Tobacco BY-2 клеткалары (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) С. Хасезава (Токио университети) тарабынан берилген.BY-2 клеткалары өзгөртүлгөн Linsmeier жана Skoog чөйрөсүндө 95 эсе суюлтулган жана 2,4-dichlorophenoxyacetic кислотасы 32 менен жума сайын толукталган.Клетка суспензиясы караңгыда 27°С 130 айн/мин айлануучу чайкагычта аралаштырылды.Жаңы чөйрөнүн көлөмү 10 эселенген клеткаларды жууп, ошол эле чөйрөдө кайра суспенди.BY-2 трансгендик клетка линиялары TagRFP-TUA6 микротүтүкчөлөрүнүн маркерин же GFP-ABD2 актин жипчелеринин маркерин түстүү капуста мозаика вирусунун 35S промоутору астында туруктуу экспрессиялоочу линиялары сүрөттөлгөндөй түзүлдү33,34,35.Бул клетка линияларын баштапкы BY-2 клетка линиясы үчүн колдонулган процедураларга окшош жол-жоболорду колдонуу менен сактоого жана синхрондоштурууга болот.
HeLa клеткалары 10% түйүлдүктүн сывороткасы, 1,2 U/мл пенициллин жана 1,2 мкг/мл стрептомицин менен 5% CO2 менен 37°C инкубатор менен толукталган Дулбеконун өзгөртүлгөн Eagle's чөйрөсүндө (DMEM) (Life Technologies) өстүрүлдү.
Бул кол жазмада сүрөттөлгөн бардык эксперименттер Япониянын биологиялык коопсуздук эрежелерине жана көрсөтмөлөрүнө ылайык аткарылган.
Кошулмалар диметил сульфоксидде (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) запастык эритмелер катары эриди жана Арабидопсис жана тамеки үчүн MS чөйрөсүндө же боор курт үчүн Gamborg B5 чөйрөсүндө суюлтулду.Тамырдын өсүшүнө бөгөт коюу анализи үчүн ар бир пластинкага 10дон ашык урук көрсөтүлгөн кошулмаларды же DMSO камтыган агар чөйрөсүнө себилген.Уруктар 7 күн бою өсүүчү камерада инкубацияланган.Көчөттөрдү сүрөткө тартып, тамырлардын узундугун ченеген.Arabidopsis өнүп чыгуусун анализдөө үчүн ар бир табакка 48 урук 200 мкм кошулма же DMSO камтыган агар чөйрөсүнө себилген.Арабидопсис уруктары өсүү камерасында өстүрүлүп, өнүп чыккан көчөттөрдүн саны өнүп чыккандан 7 күндөн кийин эсептелди (даг).Тамекинин өнүүсүнө анализ жүргүзүү үчүн ар бир табакка 24 үрөн 200 мкм КАНД же DMSO камтыган агар чөйрөсүнө себилген.Тамекинин уруктары өстүрүлгөн камерада өстүрүлүп, 14 күндөн кийин өнүп чыккан көчөттөрдүн саны эсептелген.Боор куртунун өсүшүнө бөгөт коюу анализи үчүн ар бир пластинкадан 9 эмбрион KAND же DMSO көрсөтүлгөн концентрацияларын камтыган агар чөйрөсүнө капталган жана өсүү камерасында 14 күн инкубацияланган.
5 мг / мл пропидиум йодид (PI) менен боёлгон көчөттөрдү тамыр меристемасынын түзүлүшүн элестетүү үчүн колдонуңуз.PI сигналдары TCS SPE конфокалдык лазер сканерлөөчү микроскоптун (Leica Microsystems) жардамы менен флуоресценттик микроскоп аркылуу байкалган.
β-глюкуронидаза (GUS) менен тамырларды гистохимиялык боёо Малами жана Бенфей36 сүрөттөгөн протоколго ылайык аткарылган.Көчөттөр түнү бою 90% ацетондо бекитилип, GUS буферинде 0,5 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-д-глюкурон кислотасы менен 1 саат бою боёлуп, гидратталган хлоральдегид эритмесинде жайгаштырылды.(8 г хлоралгидрат, 2 мл суу жана 1 мл глицерин) жана Axio Imager M1 микроскоптун (Карл Цейс) жардамы менен дифференциалдык интерференциялык контрасттык микроскопия менен байкалган.
Тамырдын бурчтары тик жайгаштырылган пластинкаларда өстүрүлгөн 7 күндүк көчөттөр боюнча өлчөнгөн.6-кадамда сүрөттөлгөндөй, тартылуу векторунун багытынан тамырдын бурчун өлчөңүз.
Кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн тартиби сүрөттөлгөндөй байкалган, 37 протоколуна кичине өзгөртүүлөр киргизилген.Анти-β-тубулин антителолору (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) жана Alexa Fluor 488-конъюгацияланган чычканга каршы IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) 1:1000 жана 1:10 суюлтууда негизги жана экинчилик антитело катары колдонулган. тиешелүү түрдө.Флуоресценттик сүрөттөр TCS SPE конфокалдык лазердик сканерлөөчү микроскоптун (Leica Microsystems) жардамы менен алынган.Z-стек сүрөттөрүн алуу жана өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык максималдуу интенсивдүү проекцияларды түзүңүз.
HeLa клетканын пролиферациясын анализдөө Cell Counting Kit 8 (Dojindo) менен өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык жүргүзүлдү.
E. coli DH5α өсүшү 600 нм (OD600) боюнча спектрофотометрди колдонуу менен маданиятта клетка тыгыздыгын өлчөө аркылуу талданды.
Трансгендик BY-2 клеткаларындагы цитоскелеттик уюм CSU-X1 конфокалдык сканерлөөчү аппарат (Yokogawa) жана sCMOS камерасы (Zyla, Andor Technology) менен жабдылган флуоресценттик микроскоптун жардамы менен байкалган.Цитоскелеттин тыгыздыгы сүрөттөлгөн анализдин жардамы менен бааланган, ал сүрөттөлгөндөй ImageJ программасын колдонуу менен конфокалдык сүрөттөрдөгү цитоплазмалык пикселдердин арасындагы цитоскелеттик пикселдердин пайызын аныктаган38,39.
BY-2 клеткаларында клетканын өлүмүн аныктоо үчүн клетка суспензиясынын аликвоту бөлмө температурасында 10 мүнөткө 0,05% Эванс көк менен инкубацияланган.Өлгөн клеткалардын тандалма Эванс көк түсү плазмалык мембрана40 тарабынан жашоого жөндөмдүү клеткалардан боёктун экструзиясынан көз каранды.Боёлгон клеткалар жаркыраган талаа микроскоптун (BX53, Olympus) жардамы менен байкалган.
HeLa клеткалары 37°C жана 5% CO2 нымдалган инкубатордо 10% FBS менен толукталган DMEMде өстүрүлгөн.Клеткалар 100 мкМ KAND 11, kumamonamic кислотасы 6, kumamonamide 1, 100 нг / мл колцемид (Gibco), же 100 нг / мл Nocodmaze (Sigma) менен 37 ° C 6 ч.Клеткалар MetOH менен 10 мүнөт, андан кийин бөлмө температурасында 5 мүнөт ацетат менен бекитилди.Туруктуу клеткалар 2 саат бою 0,5% BSA/PBS менен суюлтулган β-тубулиндик негизги антитело (1D4A4, Proteintech: 66240-1) менен инкубацияланган, TBST менен 3 жолу жууп, андан кийин Alexa Fluor теке антителосу менен инкубацияланган.488 1 саат.– Чычкан IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) жана 15 нг/мл 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0,5% BSA/PBS менен суюлтулган.TBST менен үч жолу жуугандан кийин, боёлгон клеткалар Nikon Eclipse Ti-E инверттүү микроскопунда байкалды.Сүрөттөр MetaMorph программасын (Молекулярдык түзмөктөр) колдонуу менен муздатылган Hamamatsu ORCA-R2 CCD камерасы менен тартылган.
Посттун убактысы: Jun-17-2024