Өсүмдүктүн апикалдык меристемасынын (SAM) өсүшү сабактын түзүлүшү үчүн абдан маанилүү. Өсүмдүк гормондоругиббереллиндер(GA) өсүмдүктөрдүн өсүшүн координациялоодо негизги ролду ойнойт, бирок алардын SAMдагы ролу азырынча начар изилденген. Бул жерде биз DELLA протеинин GA транскрипциялык реакциясындагы анын маанилүү жөнгө салуучу функциясын басуу менен GA таануу учурунда анын деградациясын сактоо менен инженериялоо жолу менен GA сигнализациясынын катыштык биосенсорун иштеп чыктык. Биз бул деградацияга негизделген биосенсор өнүгүү учурунда GA деңгээлиндеги өзгөрүүлөрдү жана клеткалык сезүүнү так жазып алаарын көрсөтөбүз. Биз бул биосенсорду SAMдагы GA сигнализациясынын активдүүлүгүн картага түшүрүү үчүн колдондук. Биз жогорку GA сигналдары негизинен түйүндөр аралык клеткалардын прекурсорлору болгон органдын алгачкы клеткаларынын ортосунда жайгашкан клеткаларда бар экенин көрсөтөбүз. Функциянын пайда болушу жана жоголушу ыкмаларын колдонуу менен биз GA клетканын бөлүнүү тегиздигинин багытын жөнгө салып, түйүндөр аралык канондук клеткалык уюмду түзөрүн, ошону менен SAMдагы түйүндөр аралык спецификацияны жогорулатарын көрсөтөбүз.
Бүчүрдүн учунда жайгашкан өркүнүн апикалдык меристемасы (БАМ) өсүмдүктүн өмүр бою модулдук жана кайталануучу түрдө каптал органдарды жана сабак түйүндөрүн пайда кылган өзөк клеткаларынын нишасын камтыйт. Бул кайталануучу бирдиктердин ар бири же өсүмдүк түйүндөрүнө түйүндөрдөгү аралык жана каптал органдар, ошондой эле жалбырактын колтуктарындагы колтук меристемалары кирет1. Өсүмдүк түйүндөрүнүн өсүшү жана уюштурулушу өнүгүү учурунда өзгөрөт. Арабидопсисте вегетативдик этапта түйүн аралык өсүш басылып, колтук меристемалары розетка жалбырактарынын колтуктарында уктап калат. Гүлдүү фазага өтүү учурунда БАМ гүлдөө меристемасына айланып, узун аралык түйүндөр жана колтук бүчүрлөрүн, гүлдүү жалбырактардын колтуктарындагы бутакчаларды жана кийинчерээк жалбыраксыз гүлдөрдү пайда кылат2. Жалбырактардын, гүлдөрдүн жана бутактардын пайда болушун көзөмөлдөгөн механизмдерди түшүнүүдө олуттуу ийгиликтерге жетишкенибиз менен, аралык түйүндөр кантип пайда болору жөнүндө салыштырмалуу аз маалымат бар.
GAлардын мейкиндик-убакыттык бөлүштүрүлүшүн түшүнүү бул гормондордун ар кандай ткандардагы жана ар кандай өнүгүү этаптарындагы функцияларын жакшыраак түшүнүүгө жардам берет. Өзүнүн промоутеринин таасири астында экспрессияланган RGA-GFP биригишинин деградациясын визуалдаштыруу тамырлардагы жалпы GA деңгээлин жөнгө салуу боюнча маанилүү маалымат берет15,16. Бирок, RGA экспрессиясы ткандарда ар кандай17 жана GA18 тарабынан жөнгө салынат. Ошентип, RGA промоутеринин дифференциалдык экспрессиясы RGA-GFP менен байкалган флуоресценция схемасына алып келиши мүмкүн жана ошондуктан бул ыкма сандык эмес. Жакында эле биоактивдүү флуоресцеин (Fl) менен белгиленген GA19,20 тамыр эндокортексинде GAнын топтолушун жана анын клеткалык деңгээлдеринин GA транспорту менен жөнгө салынышын аныктады. Жакында эле GA FRET сенсору nlsGPS1 GA деңгээли тамырлардагы, жипчелердеги жана караңгы өскөн гипокотилдердеги21 клеткалардын узарышы менен корреляцияланаарын көрсөттү. Бирок, биз көргөндөй, GA концентрациясы GA сигнал берүү активдүүлүгүн башкаруучу жалгыз параметр эмес, анткени ал татаал сезүү процесстеринен көз каранды. Бул жерде, DELLA жана GA сигнал берүү жолдору жөнүндөгү түшүнүгүбүзгө таянып, биз GA сигнал берүү үчүн деградацияга негизделген катыштык биосенсордун иштелип чыгышын жана мүнөздөмөсүн билдиребиз. Бул сандык биосенсорду иштеп чыгуу үчүн биз флуоресценттик белокко биригип, ткандарда бардык жерде экспрессияланган мутант GA-сезгич RGAны, ошондой эле GA-сезгич эмес флуоресценттик белокту колдондук. Биз мутант RGA белокторунун биригиши бардык жерде экспрессияланганда эндогендик GA сигнал берүүсүнө тоскоол болбой турганын жана бул биосенсор сенсордук аппарат тарабынан GA киргизүүсүнөн жана GA сигналын иштетүүдөн келип чыккан сигнал берүү активдүүлүгүн жогорку мейкиндик-убакыттык чечилиш менен сандык жактан аныктай алаарын көрсөтөбүз. Биз бул биосенсорду GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн мейкиндик-убакыттык бөлүштүрүлүшүн картага түшүрүү жана GA SAM эпидермисиндеги клеткалык жүрүм-турумду кантип жөнгө саларын сандык жактан аныктоо үчүн колдондук. Биз GA органдын алгачкы клеткаларынын ортосунда жайгашкан SAM клеткаларынын бөлүнүү тегиздигинин багытын жөнгө саларын, ошону менен түйүндөр аралыктын канондук клеткалык уюмун аныктай турганын көрсөтөбүз.
Акырында, биз qmRGA өсүүчү гипокотилдерди колдонуу менен эндогендик GA деңгээлиндеги өзгөрүүлөрдү билдире алабы деп сурадык. Биз мурда нитраттын GA синтезин жана өз кезегинде DELLA34 деградациясын жогорулатуу менен өсүүнү стимулдай турганын көрсөткөнбүз. Ошого ылайык, биз нитраттын мол болушу шартында (10 мМ NO3−) өстүрүлгөн pUBQ10::qmRGA көчөттөрүндөгү гипокотилдин узундугу нитрат жетишсиз шарттарда өстүрүлгөн көчөттөргө караганда бир топ узун экенин байкадык (Кошумча 6a-сүрөт). Өсүү реакциясына ылайык, 10 мМ NO3− шарттарында өстүрүлгөн көчөттөрдүн гипокотилдеринде GA сигналдары нитрат жок жерде өстүрүлгөн көчөттөргө караганда жогору болгон (Кошумча 6b, c-сүрөт). Ошентип, qmRGA ошондой эле GA концентрациясындагы эндогендик өзгөрүүлөрдөн улам пайда болгон GA сигнализациясынын өзгөрүүлөрүн көзөмөлдөөгө мүмкүндүк берет.
qmRGA тарабынан аныкталган GA сигнал берүү активдүүлүгү GA концентрациясына жана GA кабылдоосуна көз каранды экенин түшүнүү үчүн, сенсордун дизайнына негизделгендей, биз вегетативдик жана репродуктивдик ткандардагы үч GID1 рецепторунун экспрессиясын талдадык. Көчөттөрдө GID1-GUS репортер линиясы GID1a жана c өсүмдүктөрдүн жалбырактарында жогорку деңгээлде экспрессияланганын көрсөттү (3a–c сүрөт). Мындан тышкары, үч рецептор тең жалбырактарда, каптал тамырдын алгачкы сабактарында, тамырдын учтарында (GID1b тамыр капкагынан тышкары) жана кан тамыр системасында экспрессияланган (3a–c сүрөт). Гүлдүү SAMда биз GUS сигналдарын GID1b жана 1c үчүн гана аныктадык (7a–c кошумча сүрөт). In situ гибриддештирүү бул экспрессия үлгүлөрүн тастыктады жана GID1c SAMда төмөнкү деңгээлде бирдей экспрессияланганын, ал эми GID1b SAMдын четинде жогорку экспрессияны көрсөткөнүн көрсөттү (7d–l кошумча сүрөт). pGID1b::2xmTQ2-GID1b трансляциялык биригүүсү SAMдын борборунда төмөн же эч кандай экспрессиядан органдын чектеринде жогорку экспрессияга чейин GID1b экспрессиясынын градацияланган диапазонун көрсөттү (7m-кошумча сүрөт). Ошентип, GID1 рецепторлору ткандардын ичинде жана арасында бирдей бөлүштүрүлгөн эмес. Кийинки эксперименттерде биз GID1дин (pUBQ10::GID1a-mCherry) ашыкча экспрессиясы гипокотилдердеги qmRGAнын тышкы GA колдонууга сезгичтигин жогорулаткандыгын байкадык (3d-сүрөт, e). Ал эми гипокотилде qd17mRGA менен өлчөнгөн флуоресценция GA3 менен дарылоого сезгич эмес болгон (3f-сүрөт, g). Эки анализ үчүн тең сенсордун тез жүрүм-турумун баалоо үчүн көчөттөр GAнын жогорку концентрациялары (100 мкМ GA3) менен иштетилген, мында GID1 рецепторуна байланышуу жөндөмү жогорулаган же жоголгон. Бул жыйынтыктар биргелешип, qmRGA биосенсору GA жана GA сенсору катары айкалышкан функцияны аткараарын тастыктайт жана GID1 рецепторунун дифференциалдык экспрессиясы сенсордун эмиссиясын олуттуу түрдө модуляциялай аларын көрсөтүп турат.
Бүгүнкү күнгө чейин SAMдагы GA сигналдарынын таралышы белгисиз бойдон калууда. Ошондуктан, биз qmRGA экспрессиялоочу өсүмдүктөрдү жана pCLV3::mCherry-NLS өзөк клетка репортерин35 колдонуп, GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн жогорку чечилиштеги сандык карталарын эсептеп чыктык, L1 катмарына (эпидермис; 4a, b сүрөт, Методдор жана Кошумча методдорду караңыз) көңүл бурдук, анткени L1 SAM өсүшүн көзөмөлдөөдө маанилүү ролду ойнойт36. Бул жерде pCLV3::mCherry-NLS экспрессиясы GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн мейкиндик-убакыттык таралышын талдоо үчүн туруктуу геометриялык шилтеме чекитин камсыз кылды37. GA каптал органдардын өнүгүшү үчүн маанилүү деп эсептелгени менен4, биз P3 этабынан баштап гүлдүү примордиумда (P) GA сигналдары төмөн болгонун байкадык (4a, b сүрөт), ал эми жаш P1 жана P2 примордиумдары борбордук аймактагыга окшош орточо активдүүлүккө ээ болгон (4a, b сүрөт). Жогорку GA сигнал берүү активдүүлүгү органдын примордиум чектеринде, P1/P2ден (чек аранын капталдарынан) баштап, P4кө чейин жеткенде, ошондой эле примордиалардын ортосунда жайгашкан перифериялык аймактын бардык клеткаларында аныкталган (4a, b-сүрөт жана кошумча 8a, b-сүрөт). Бул жогорку GA сигнал берүү активдүүлүгү эпидермисте гана эмес, L2 жана жогорку L3 катмарларында да байкалган (кошумча 8b-сүрөт). qmRGA колдонуу менен SAMда аныкталган GA сигналдарынын схемасы да убакыттын өтүшү менен өзгөрбөгөн бойдон калган (кошумча 8c–f, k-сүрөт). qd17mRGA конструкциясы биз деталдуу мүнөздөгөн беш көз карандысыз линиядан алынган T3 өсүмдүктөрүнүн SAMында системалуу түрдө төмөндөтүлгөнү менен, биз pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP конструкциясы менен алынган флуоресценция схемаларын талдай алдык (кошумча 8g–j, l-сүрөт). Бул контролдук сызыкта SAMда флуоресценция катышында анча чоң эмес өзгөрүүлөр гана байкалган, бирок SAM борборунда биз TagBFP менен байланышкан VENUSтун ачык жана күтүлбөгөн төмөндөшүн байкадык. Бул qmRGA тарабынан байкалган сигнал берүү схемасы mRGA-VENUSтун GAга көз каранды деградациясын чагылдыраарын тастыктайт, бирок ошондой эле qmRGA меристема борборунда GA сигнал берүү активдүүлүгүн жогору баалашы мүмкүн экенин көрсөтөт. Кыскача айтканда, биздин жыйынтыктарыбыз негизинен примордиялардын таралышын чагылдырган GA сигнал берүү схемасын ачып берет. Баштапкы аралык аймактын (IPR) мындай таралышы өнүгүп келе жаткан примордий менен борбордук аймактын ортосунда жогорку GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн акырындык менен орношуна байланыштуу, ошол эле учурда примордийдеги GA сигнал берүү активдүүлүгү төмөндөйт (4c, d-сүрөт).
GID1b жана GID1c рецепторлорунун бөлүштүрүлүшү (жогоруда караңыз) GA рецепторлорунун дифференциалдык экспрессиясы SAMдагы GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн схемасын калыптандырууга жардам берерин көрсөтүп турат. Биз GAнын дифференциалдык топтолушуна катышы барбы деп ойлондук. Бул мүмкүнчүлүктү изилдөө үчүн биз nlsGPS1 GA FRET сенсорун колдондук21. 100 мүнөт бою 10 мкМ GA4+7 менен иштетилген nlsGPS1дин SAMында активдешүү жыштыгынын жогорулаганы аныкталды (кошумча сүрөт 9a–e), бул nlsGPS1 тамырлардагыдай эле SAMдагы GA концентрациясынын өзгөрүшүнө жооп берерин көрсөтүп турат21. nlsGPS1 активдешүү жыштыгынын мейкиндик бөлүштүрүлүшү SAMдын сырткы катмарларында GA деңгээлинин салыштырмалуу төмөн экендигин көрсөттү, бирок алардын борборунда жана SAMдын чектеринде жогорулаганын көрсөттү (4e сүрөт жана кошумча сүрөт 9a,c). Бул GA SAMда да qmRGA тарабынан аныкталганга окшош мейкиндик схемасы менен бөлүштүрүлгөнүн көрсөтүп турат. Кошумча ыкма катары, биз SAMды флуоресценттик GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) же терс контрол катары жалгыз Fl менен дарыладык. Fl сигналы SAM боюнча, анын ичинде борбордук аймакты жана примордийди кошо алганда, төмөнкү интенсивдүүлүктө бөлүштүрүлгөн (4j-сүрөт жана кошумча 10d-сүрөт). Ал эми үч GA-Fl тең примордийдин чек араларында жана IPRдин калган бөлүгүндө ар кандай деңгээлде топтолуп, GA7-Fl IPRдеги эң чоң доменде топтолду (4k-сүрөт жана кошумча 10a,b-сүрөт). Флуоресценциянын интенсивдүүлүгүн сандык баалоо GA-Fl менен иштетилген SAMда IPRдин IPR эмес интенсивдүүлүгүнө болгон катышы Fl менен иштетилген SAMга салыштырмалуу жогору экенин көрсөттү (4l-сүрөт жана кошумча 10c-сүрөт). Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар GA органдын чек арасына жакын жайгашкан IPR клеткаларында жогорку концентрацияларда бар экенин көрсөтүп турат. Бул SAM GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн схемасы GA рецепторлорунун дифференциалдык экспрессиясынан жана органдардын чек араларына жакын IPR клеткаларында GAнын дифференциалдык топтолушунан келип чыгаарын көрсөтүп турат. Ошентип, биздин анализ SAMдын борборунда жана примордиумунда төмөн активдүүлүк жана перифериялык аймакта IPRде жогорку активдүүлүк менен GA сигнал берүүсүнүн күтүлбөгөн мейкиндик-убакыт схемасын аныктады.
SAMдагы дифференциалдык GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн ролун түшүнүү үчүн, биз SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS реалдуу убакыт режиминдеги сүрөткө тартууну колдонуу менен GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн, клетканын кеңейишинин жана клетканын бөлүнүүсүнүн ортосундагы корреляцияны талдап чыктык. Өсүүнү жөнгө салуудагы GAнын ролун эске алуу менен, клетканын кеңейүү параметрлери менен оң корреляция күтүлгөн. Ошондуктан, биз алгач GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн карталарын клетка бетинин өсүү ылдамдыгынын карталары менен (берилген клетка үчүн жана бөлүнүүдөгү кыз клеткалар үчүн клетканын кеңейүү күчүнүн проксиси катары) жана клетканын кеңейүүсүнүн багытын өлчөөчү өсүү анизотропиясынын карталары менен салыштырдык (бул жерде берилген клетка жана бөлүнүүдөгү кыз клеткалар үчүн да колдонулат; 5a,b-сүрөт, Методдор жана Кошумча методдорду караңыз). SAM клеткаларынын бетинин өсүү ылдамдыгынын карталарыбыз мурунку байкоолорго дал келет38,39, чек арада минималдуу өсүү ылдамдыгы жана өнүгүп келе жаткан гүлдөрдүн максималдуу өсүү ылдамдыгы менен (5a-сүрөт). Негизги компоненттик анализ (PCA) GA сигнал берүү активдүүлүгү клетка бетинин өсүү интенсивдүүлүгү менен терс корреляцияланганын көрсөттү (5c-сүрөт). Ошондой эле, биз GA сигнал берүү киришин жана өсүү интенсивдүүлүгүн кошо алганда, вариациянын негизги октору жогорку CLV3 экспрессиясы менен аныкталган багытка ортогоналдуу экенин көрсөттүк, бул калган анализдерде клеткалардын SAM борборунан чыгарылышын тастыктады. Спирмен корреляциялык анализи PCA жыйынтыктарын тастыктады (5d-сүрөт), бул IPRдеги жогорку GA сигналдары клетканын жогору кеңейишине алып келбегенин көрсөтүп турат. Бирок, корреляциялык анализ GA сигнал берүү активдүүлүгү менен өсүү анизотропиясынын ортосундагы бир аз оң корреляцияны көрсөттү (5c, d-сүрөт), бул IPRдеги жогорку GA сигнал берүү клетканын өсүү багытына жана, балким, клетканын бөлүнүү тегиздигинин абалына таасир этерин көрсөтүп турат.
a, b SAMдагы орточо беттик өсүштүн (a) жана өсүү анизотропиясынын (b) жылуулук карталары жети көз карандысыз өсүмдүк боюнча орточо эсеп менен алынган (клетканын кеңейишинин күчү жана багыты үчүн прокси катары колдонулган). c PCA анализи төмөнкү өзгөрмөлөрдү камтыган: GA сигналы, беттик өсүү интенсивдүүлүгү, беттик өсүү анизотропиясы жана CLV3 экспрессиясы. PCA компоненти 1 негизинен беттик өсүү интенсивдүүлүгү менен терс корреляцияланган жана GA сигналы менен оң корреляцияланган. PCA компоненти 2 негизинен беттик өсүү анизотропиясы менен оң корреляцияланган жана CLV3 экспрессиясы менен терс корреляцияланган. Пайыздар ар бир компонент менен түшүндүрүлгөн вариацияны билдирет. d CZди кошпогондо, ткандардын масштабында GA сигналы, беттик өсүү интенсивдүүлүгү жана беттик өсүү анизотропиясынын ортосундагы Спирмен корреляциясын талдоо. Оң жактагы сан - эки өзгөрмөнүн ортосундагы Спирмен rho мааниси. Жылдызчалар корреляция/терс корреляция өтө маанилүү болгон учурларды көрсөтөт. e Col-0 SAM L1 клеткаларын конфокалдык микроскопия аркылуу 3D визуализациялоо. 10 сааттан кийин SAMда (бирок примордийде эмес) пайда болгон жаңы клетка дубалдары бурчтук маанилерине жараша түскө боёлгон. Түс тилкеси төмөнкү оң бурчта көрсөтүлгөн. Киргизилген сүрөттө 0 сааттан кийин тиешелүү 3D сүрөт көрсөтүлгөн. Эксперимент окшош натыйжалар менен эки жолу кайталанган. f Кутуча графиктери IPR жана IPR эмес Col-0 SAMда (n = 10 көз карандысыз өсүмдүктөр) клеткалардын бөлүнүү ылдамдыгын көрсөтөт. Борбордук сызык медиананы көрсөтөт, ал эми кутучанын чек аралары 25-чи жана 75-чи процентилдерди көрсөтөт. Муруттар R программасы менен аныкталган минималдуу жана максималдуу маанилерди көрсөтөт. P маанилери Уэлчтин эки куйруктуу t-тестинин жардамы менен алынган. g, h Схематикалык диаграмма (g) жаңы клетка дубалынын (кызгылтым түстүн) SAMдын борборунан радиалдык багытка карата бурчун кантип өлчөө керектигин көрсөтөт (ак чекиттүү сызык) (курч бурч маанилери, б.а. 0–90° гана эске алынат) жана (h) меристеманын ичиндеги айланма/каптал жана радиалдык багыттарды көрсөтөт. i SAM (кочкул көк), IPR (орто көк) жана IPR эмес (ачык көк) боюнча клетканын бөлүнүү тегиздигинин багытынын жыштык гистограммалары. P маанилери эки куйруктуу Колмогоров-Смирнов тести менен алынган. Эксперимент эки жолу кайталанып, окшош натыйжалар алынган. j IPRдин тиешелүүлүгүнө жараша P3 (ачык жашыл), P4 (орто жашыл) жана P5 (кочкул жашыл) айланасындагы клетканын бөлүнүү тегиздигинин багытынын жыштык гистограммалары. P маанилери эки куйруктуу Колмогоров-Смирнов тести менен алынган. Эксперимент эки жолу кайталанып, окшош натыйжалар алынган.
Ошондуктан, биз андан кийин анализ учурунда жаңы пайда болгон клетка дубалдарын аныктоо менен GA сигнализациясы менен клетканын бөлүнүү активдүүлүгүнүн ортосундагы корреляцияны изилдедик (5e-сүрөт). Бул ыкма бизге клетканын бөлүнүү жыштыгын жана багытын өлчөөгө мүмкүндүк берди. Таң калыштуусу, биз IPRдеги жана SAMдын калган бөлүгүндөгү (IPR эмес, 5f-сүрөт) клетканын бөлүнүү жыштыгы окшош экенин аныктадык, бул IPR жана IPR эмес клеткалардын ортосундагы GA сигнализациясындагы айырмачылыктар клетканын бөлүнүүсүнө олуттуу таасир этпей турганын көрсөтүп турат. Бул жана GA сигнализациясы менен өсүү анизотропиясынын ортосундагы оң корреляция бизди GA сигнализациясынын активдүүлүгү клетканын бөлүнүү тегиздигинин багытына таасир эте алабы же жокпу деген маселени карап көрүүгө түрткү болду. Биз жаңы клетка дубалынын багытын меристеманын борборун жана жаңы клетка дубалынын борборун туташтырган радиалдык огуна карата курч бурч катары өлчөдүк (5e-i сүрөт) жана клеткалардын радиалдык огуна карата 90° жакын бурчтарда бөлүнүү тенденциясын байкадык, эң жогорку жыштыктар 70–80° (23,28%) жана 80–90° (22,62%) (5e,i сүрөт) байкалды, бул клеткалардын айлана/туурасынан кеткен багыттагы бөлүнүүсүнө туура келет (5h сүрөт). GA сигнализациясынын клетканын бул бөлүнүү жүрүм-турумуна кошкон салымын изилдөө үчүн, биз IPRдеги жана IPR эмес клеткалардын бөлүнүү параметрлерин өзүнчө талдадык (5i сүрөт). Биз IPR клеткаларындагы бөлүнүү бурчу IPR эмес клеткалардагы же бүтүндөй SAM клеткаларындагыдан айырмаланарын байкадык, IPR клеткалары каптал/тегерек клетка бөлүнүүлөрүнүн жогорку үлүшүн, башкача айтканда, 70–80° жана 80–90° (тиешелүү түрдө 33,86% жана 30,71%) көрсөтүштү (5i-сүрөт). Ошентип, биздин байкоолорубуз жогорку GA сигнализациясы менен айланма багытка жакын клетка бөлүнүү тегиздигинин багытынын ортосундагы байланышты көрсөттү, бул GA сигнализация активдүүлүгү менен өсүү анизотропиясынын ортосундагы корреляцияга окшош (5c, d-сүрөт). Бул байланыштын мейкиндикте сакталышын андан ары аныктоо үчүн, биз P3төн баштап примордиумду курчап турган IPR клеткаларындагы бөлүнүү тегиздигинин багытын өлчөдүк, анткени бул аймакта P4төн баштап эң жогорку GA сигнализация активдүүлүгү аныкталган (4-сүрөт). IPRдин P3 жана P4 айланасындагы бөлүнүү бурчтары статистикалык жактан маанилүү айырмачылыктарды көрсөткөн жок, бирок P4 айланасындагы IPRде каптал клетка бөлүнүүлөрүнүн жыштыгынын жогорулаганы байкалган (5j-сүрөт). Бирок, P5 айланасындагы IPR клеткаларында клетканын бөлүнүү тегиздигинин багытындагы айырма статистикалык жактан маанилүү болуп, туурасынан кеткен клетка бөлүнүү жыштыгынын кескин жогорулашы байкалган (5j-сүрөт). Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар GA сигнализациясы SAMдагы клетка бөлүнүүлөрүнүн багытын башкара аларын көрсөтүп турат, бул жогорку GA сигнализациясы IPRдеги клетка бөлүнүүлөрүнүн каптал багытын пайда кылышы мүмкүн деген мурунку отчетторго дал келет40,41.
IPRдеги клеткалар примордияга эмес, түйүндөр аралык түйүндөргө киргизилет деп болжолдонууда2,42,43. IPRдеги клетка бөлүнүүлөрүнүн туурасынан багыты түйүндөр аралык түйүндөрдөгү эпидермалдык клеткалардын параллелдүү узунунан катарларынын типтүү уюшулушуна алып келиши мүмкүн. Жогоруда баяндалган байкоолорубуз GA сигнализациясы клетка бөлүнүү багытын жөнгө салуу менен бул процессте роль ойной тургандыгын көрсөтүп турат.
Бир нече DELLA гендеринин функциясынын жоголушу конститутивдик GA реакциясына алып келет жана бул гипотезаны текшерүү үчүн делла мутанттарын колдонсо болот44. Биз алгач SAMдагы беш DELLA генинин экспрессия үлгүлөрүн талдап чыктык. GUS линиясынын45 транскрипциялык биригиши GAI, RGA, RGL1 жана RGL2 (бир топ аз өлчөмдө) SAMда экспрессияланганын көрсөттү (Кошумча 11a–d сүрөт). In situ гибриддештирүү GAI мРНКсы примордияларда жана өнүгүп келе жаткан гүлдөрдө атайын топтолоорун көрсөттү (Кошумча 11e сүрөт). RGL1 жана RGL3 мРНКсы SAM чатырынын бардык жеринде жана эски гүлдөрдө аныкталган, ал эми RGL2 мРНКсы чек ара аймагында көбүрөөк болгон (Кошумча 11f–h сүрөт). pRGL3::RGL3-GFP SAM конфокалдык сүрөткө тартуу in situ гибриддештирүү менен байкалган экспрессияны тастыктады жана RGL3 белогу SAMдын борбордук бөлүгүндө топтолоорун көрсөттү (Кошумча 11i сүрөт). pRGA::GFP-RGA линиясын колдонуп, биз RGA белогу SAMда топтолорун, бирок анын саны P4төн баштап чек арада азайарын аныктадык (Кошумча 11j-сүрөт). Белгилей кетчү нерсе, RGL3 жана RGA экспрессия үлгүлөрү qmRGA тарабынан аныкталгандай, IPRдеги жогорку GA сигнал берүү активдүүлүгүнө шайкеш келет (4-сүрөт). Андан тышкары, бул маалыматтар бардык DELLAлар SAMда экспрессияланганын жана алардын экспрессиясы жалпысынан бүт SAMды камтыганын көрсөтүп турат.
Андан кийин биз жапайы типтеги SAM (Ler, контролдук) жана gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della бешинчи (глобалдык) мутанттарындагы клетка бөлүнүү параметрлерин талдадык (6a, b-сүрөт). Кызыктуусу, биз della глобалдык мутант SAMда жапайы типке салыштырмалуу клетка бөлүнүү бурчунун жыштыктарынын бөлүштүрүлүшүндө статистикалык жактан маанилүү жылыш байкадык (6c-сүрөт). della глобалдык мутантындагы бул өзгөрүү 80–90° бурчтардын (34,71% vs. 24,55%) жана анча чоң эмес деңгээлде 70–80° бурчтардын (23,78% vs. 20,18%) жыштыгынын жогорулашынан улам болгон, башкача айтканда, туурасынан кеткен клетка бөлүнүүлөрүнө туура келет (6c-сүрөт). Туурасынан кеткен эмес бөлүнүүлөрдүн жыштыгы (0–60°) della глобалдык мутантында да төмөн болгон (6c-сүрөт). della глобалдык мутантынын SAMында туурасынан кеткен клетка бөлүнүү жыштыгы бир кыйла жогорулаган (6b-сүрөт). IPRдеги туурасынан кеткен клетка бөлүнүү жыштыгы della глобалдык мутантында жапайы типке салыштырмалуу жогору болгон (6d-сүрөт). IPR аймагынан тышкары, жапайы типте клетка бөлүнүү бурчтары бирдей бөлүштүрүлгөн, ал эми della глобалдык мутант IPR сыяктуу тангенциалдык бөлүнүүлөрдү артык көргөн (6e-сүрөт). Ошондой эле, GA топтолуучу GA-активдүү эмес мутанттык фон болгон ga2 оксидаза (ga2ox) беш мутанттарынын (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 жана ga2ox6-2) SAMындагы клетка бөлүнүүлөрүнүн багытын сандык жактан аныктадык. GA деңгээлинин жогорулашына ылайык, беш ga2ox мутант гүлүнүн SAMы Col-0го караганда чоңураак болгон (12a-кошумча сүрөт, b) жана Col-0го салыштырмалуу беш ga2ox SAM клетканын бөлүнүү бурчтарынын айырмаланган бөлүштүрүлүшүн көрсөттү, бурчтун жыштыгы 50°тан 90°ка чейин жогорулады, башкача айтканда, кайрадан тангенциалдык бөлүнүүлөрдү колдоду (12a–c-кошумча сүрөт). Ошентип, биз GA сигнализациясынын жана GA топтолушунун конститутивдик активдешүүсү IPRде жана SAMдын калган бөлүгүндө каптал клеткалардын бөлүнүшүн пайда кыларын көрсөтөбүз.
a, b PI менен боёлгон Ler (a) жана глобалдык делла мутант (b) SAMдын L1 катмарынын конфокалдык микроскопияны колдонуу менен 3D визуализациясы. 10 сааттык мезгил ичинде SAMда (бирок примордиумда эмес) пайда болгон жаңы клетка дубалдары көрсөтүлгөн жана алардын бурчтук маанилерине жараша боёлгон. Киргизилген сүрөттө 0 сааттагы SAM көрсөтүлгөн. Түс тилкеси төмөнкү оң бурчта көрсөтүлгөн. (b)деги жебе глобалдык делла мутантындагы тегизделген клетка файлдарынын мисалына көрсөтүп турат. Эксперимент окшош натыйжалар менен эки жолу кайталанган. ce Ler жана глобалдык делла ортосундагы бүтүндөй SAM (d), IPR (e) жана IPR эмес (f) клетка бөлүнүү тегиздигинин багыттарынын жыштыктык бөлүштүрүлүшүн салыштыруу. P маанилери эки куйруктуу Колмогоров-Смирнов тести аркылуу алынган. f, g Col-0 (i) жана pCUC2::gai-1-VENUS (j) трансгендик өсүмдүктөрүнүн PI менен боёлгон SAMынын конфокалдык сүрөттөрүнүн 3D визуализациясы. (a, b) панелдеринде SAMда 10 сааттын ичинде пайда болгон жаңы клетка дубалдары (бирок примордиялар эмес) көрсөтүлгөн. Эксперимент окшош натыйжалар менен эки жолу кайталанган. h–j Col-0 жана pCUC2::gai-1-VENUS өсүмдүктөрүнүн ортосундагы SAM (h), IPR (i) жана IPR эмес (j) бүтүндөй аймагында жайгашкан клетканын бөлүнүү тегиздигинин багыттарынын жыштыктык бөлүштүрүлүшүн салыштыруу. P маанилери эки куйруктуу Колмогоров-Смирнов тести аркылуу алынган.
Андан кийин биз GA сигнализациясын басуунун таасирин атайын IPRде сынап көрдүк. Бул үчүн биз VENUS менен биригишкен доминанттык терс gai-1 протеининин экспрессиясын стимулдаштыруу үчүн котиледон чөйчөгү 2 (CUC2) промоутерин колдондук (pCUC2::gai-1-VENUS линиясында). Жапайы типтеги SAMда CUC2 промоутери P4төн баштап чек ара клеткаларын кошо алганда, SAMдагы көпчүлүк IPRлердин экспрессиясын стимулдайт жана ушул сыяктуу өзгөчө экспрессия pCUC2::gai-1-VENUS өсүмдүктөрүндө байкалган (төмөндө караңыз). pCUC2::gai-1-VENUS өсүмдүктөрүнүн SAM же IPR боюнча клетка бөлүнүү бурчтарынын бөлүштүрүлүшү жапайы типтегиден олуттуу айырмаланган жок, бирок күтүлбөгөн жерден бул өсүмдүктөрдө IPR жок клеткалар 80–90° жогорку жыштыкта бөлүнөрүн аныктадык (6f–j-сүрөт).
Клетканын бөлүнүү багыты SAMдын геометриясына, атап айтканда, ткандардын ийрилигинен улам пайда болгон созулуш чыңалуусуна көз каранды деген божомолдор бар46. Ошондуктан, биз SAMдын формасы della global мутантында жана pCUC2::gai-1-VENUS өсүмдүктөрүндө өзгөргөнбү деп сурадык. Буга чейин кабарлангандай12, della global мутант SAMдын өлчөмү жапайы типтегиге караганда чоңураак болгон (Кошумча сүрөт 13a, b, d). CLV3 жана STM РНКнын in situ гибриддештирилиши della мутанттарындагы меристеманын кеңейишин тастыктады жана андан ары өзөк клеткасынын нишасынын каптал кеңейишин көрсөттү (Кошумча сүрөт 13e, f, h, i). Бирок, SAM ийрилиги эки генотипте тең окшош болгон (Кошумча сүрөт 13k, m, n, p). Биз gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple мутантында жапайы түргө салыштырмалуу ийрилик өзгөрбөстөн, өлчөмдө окшош өсүштү байкадык (13c, d, g, j, l, o, p кошумча сүрөт). Клетканын бөлүнүү багытынын жыштыгы della quadruple мутантында да таасир эткен, бирок della monolith мутантына караганда азыраак деңгээлде (12d–f кошумча сүрөт). Бул дозалык эффект, ийриликке таасирдин жоктугу менен бирге, Della quadruple мутантындагы калдык RGL3 активдүүлүгү DELLA активдүүлүгүнүн жоголушунан улам клетканын бөлүнүү багытынын өзгөрүшүн чектей турганын жана каптал клетка бөлүнүүлөрүндөгү өзгөрүүлөр SAM геометриясындагы өзгөрүүлөргө эмес, GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн өзгөрүшүнө жооп катары пайда болорун көрсөтүп турат. Жогоруда айтылгандай, CUC2 промотору SAMда IPR экспрессиясын P4төн баштап иштетет (14a, b кошумча сүрөт), ал эми pCUC2::gai-1-VENUS SAM кичирейтилген өлчөмүнө ээ, бирок ийрилиги жогору болгон (14c–h кошумча сүрөт). pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологиясындагы бул өзгөрүү механикалык чыңалуулардын жапайы типке салыштырмалуу башкача бөлүштүрүлүшүнө алып келиши мүмкүн, мында жогорку айлана чыңалуулары SAM борборунан кыска аралыкта башталат47. Же болбосо, pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологиясындагы өзгөрүүлөр трансген экспрессиясынан улам пайда болгон аймактык механикалык касиеттердин өзгөрүшүнөн келип чыгышы мүмкүн48. Эки учурда тең, бул клеткалардын айлана/туурасынан кеткен багытта бөлүнүү ыктымалдыгын жогорулатуу менен GA сигнализациясындагы өзгөрүүлөрдүн таасирин жарым-жартылай компенсациялай алат, бул биздин байкоолорубузду түшүндүрөт.
Жалпысынан алганда, биздин маалыматтар жогорку GA сигнализациясы IPRдеги клетка бөлүнүү тегиздигинин каптал багытында активдүү ролду ойной турганын тастыктайт. Ошондой эле, алар меристеманын ийрилиги IPRдеги клетка бөлүнүү тегиздигинин багытына да таасир этерин көрсөтүп турат.
IPRдеги бөлүнүү тегиздигинин туурасынан багыты, GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн жогору болушунан улам, GA кийинчерээк эпидермис аралык түйүндө табыла турган клеткалык уюмду аныктоо үчүн SAMдын ичиндеги эпидермистеги радиалдык клетка файлын алдын ала уюштураарын көрсөтүп турат. Чынында эле, мындай клетка файлдары della global мутанттарынын SAM сүрөттөрүндө көп кездешкен (6b-сүрөт). Ошентип, SAMдагы GA сигнал берүүсүнүн мейкиндик схемасынын өнүгүү функциясын андан ары изилдөө үчүн, биз жапайы типтеги (Ler жана Col-0), della global мутанттарында жана pCUC2::gai-1-VENUS трансгендик өсүмдүктөрүндөгү IPRдеги клеткалардын мейкиндик уюмун талдоо үчүн убакыт аралыгын сүрөткө тартууну колдондук.
Биз qmRGA IPRдеги GA сигнал берүү активдүүлүгү P1/P2ден жогорулап, P4кө жеткенин көрсөткөнүн жана бул схема убакыттын өтүшү менен туруктуу бойдон калганын аныктадык (4a–f сүрөт жана 8c–f, k кошумча сүрөт). GA сигналынын көбөйүшү менен IPRдеги клеткалардын мейкиндиктеги түзүлүшүн талдоо үчүн, биз Ler IPR клеткаларын P4түн жогору жагына жана капталдарына биринчи байкоодон 34 саат өткөндөн кийин талданган өнүгүү тагдырына, башкача айтканда, экиден ашык пластид жолу менен белгиледик, бул бизге P1/P2ден P4кө чейинки алгачкы өнүгүү учурунда IPR клеткаларын байкоого мүмкүндүк берди. Биз үч башка түстү колдондук: P4кө жакын алгачкы клеткаларга интеграцияланган клеткалар үчүн сары, IPRде болгондор үчүн жашыл жана эки процесске тең катышкандар үчүн кочкул кызыл (7a–c сүрөт). t0до (0 саат) P4түн алдында IPR клеткаларынын 1–2 катмары көрүнүп турган (7a сүрөт). Күтүлгөндөй, бул клеткалар бөлүнгөндө, алар негизинен туурасынан кеткен бөлүнүү тегиздиги аркылуу бөлүнүшкөн (7a–c сүрөттөр). Ушул сыяктуу натыйжалар Col-0 SAMди колдонуу менен алынган (P3кө басым жасалып, анын чеги Lerде P4кө окшош бүктөлөт), бирок бул генотипте гүлдүн чегинде пайда болгон бүктөө IPR клеткаларын тезирээк жашырган (7g–i-сүрөт). Ошентип, IPR клеткаларынын бөлүнүү схемасы клеткаларды түйүндөр аралык сыяктуу радиалдык катарларга алдын ала уюштурат. Радиалдык катарлардын уюштурулушу жана IPR клеткаларынын удаалаш органдардын ортосунда жайгашуусу бул клеткалардын түйүндөр аралык башталгычтар экенин көрсөтүп турат.
Бул жерде биз GA жана GA рецепторлорунун айкалышкан концентрацияларынан келип чыккан GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн сандык картасын түзүүгө мүмкүндүк берген, ошол эле учурда эндогендик сигнал берүү жолдоруна тоскоолдуктарды минималдаштырууга мүмкүндүк берген, ошону менен клеткалык деңгээлде GA функциясы жөнүндө маалымат берген катыштык GA сигнал берүү биосенсорун, qmRGA, иштеп чыктык. Ушул максатта биз DELLA өз ара аракеттенүү өнөктөштөрүн байланыштыруу жөндөмүн жоготкон, бирок GA тарабынан индукцияланган протеолизге сезгич бойдон калган модификацияланган DELLA белогун, mRGA, курдук. qmRGA GA деңгээлдериндеги экзогендик жана эндогендик өзгөрүүлөргө жооп берет жана анын динамикалык сезүү касиеттери өнүгүү учурунда GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн мейкиндик-убакыттык өзгөрүүлөрүн баалоого мүмкүндүк берет. qmRGA ошондой эле абдан ийкемдүү курал болуп саналат, анткени аны экспрессиялоо үчүн колдонулган промоторду өзгөртүү менен (зарыл болсо) ар кандай ткандарга ылайыкташтырууга болот жана GA сигнал берүү жолунун жана ангиоспермдердеги PFYRE мотивинин сакталган мүнөзүн эске алганда, ал башка түрлөргө өткөрүлүп берилиши мүмкүн22. Буга ылайык, күрүч SLR1 DELLA белогундагы (HYY497AAA) эквиваленттүү мутация SLR1дин өсүү репрессордук активдүүлүгүн басары жана анын GA аркылуу деградацияланышын бир аз гана азайтары, mRGA23кө окшош экени көрсөтүлдү. Белгилей кетчү нерсе, Arabidopsisтеги акыркы изилдөөлөр PFYRE домениндеги (S474L) бир аминокислота мутациясы RGAнын транскрипциялык активдүүлүгүн өзгөртүп, анын транскрипция факторунун өнөктөштөрү менен өз ара аракеттенүү жөндөмүнө таасир этпестен өзгөрткөнүн көрсөттү50. Бул мутация mRGAда болгон 3 аминокислота алмаштыруусуна абдан жакын болсо да, биздин изилдөөлөр бул эки мутация DELLAнын ар кандай мүнөздөмөлөрүн өзгөртөрүн көрсөтүп турат. Транскрипция факторунун көпчүлүк өнөктөштөрү DELLA26,51дин LHR1 жана SAW домендерине байланса да, PFYRE домениндеги кээ бир сакталган аминокислоталар бул өз ара аракеттенүүлөрдү турукташтырууга жардам бериши мүмкүн.
Түйүндөрдүн ортосундагы өнүгүү өсүмдүк архитектурасындагы жана түшүмдүүлүктү жогорулатуудагы негизги белги болуп саналат. qmRGA IPR түйүндөрдүн ортосундагы баштапкы клеткаларда GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн жогору экенин көрсөттү. Сандык сүрөткө тартууну жана генетиканы айкалыштыруу менен, биз GA сигнал берүү үлгүлөрү SAM эпидермисинде тегерек/туурасынан кеткен клетка бөлүнүү тегиздиктерин үстүнө коюп, түйүндөрдүн ортосундагы өнүгүү үчүн зарыл болгон клетка бөлүнүү уюмун калыптандыраарын көрсөттүк. Иштеп чыгуу учурунда клетка бөлүнүү тегиздигинин багытынын бир нече жөнгө салуучулары аныкталган52,53. Биздин иш GA сигнал берүү активдүүлүгү бул клеткалык параметрди кандайча жөнгө салаарынын ачык мисалы болуп саналат. DELLA алдын ала бүктөлүүчү белок комплекстери менен өз ара аракеттене алат41, ошондуктан GA сигнал берүү кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн багытына түздөн-түз таасир этүү менен клетка бөлүнүү тегиздигинин багытын жөнгө салышы мүмкүн40,41,54,55. Биз күтүлбөгөн жерден SAMда GA сигнал берүү активдүүлүгүнүн жогорку корреляциясы клетканын узарышы же бөлүнүшү эмес, өсүү анизотропиясы гана экенин көрсөттүк, бул GAнын IPRдеги клетка бөлүнүү багытына түздөн-түз таасири менен шайкеш келет. Бирок, бул таасир кыйыр түрдө да болушу мүмкүн экенин жокко чыгара албайбыз, мисалы, GA тарабынан индукцияланган клетка дубалынын жумшартылышы56 аркылуу. Клетка дубалынын касиеттеринин өзгөрүшү механикалык стрессти пайда кылат57,58, ал ошондой эле кортикалдык микротүтүкчөлөрдүн багытына таасир этүү менен клетканын бөлүнүү тегиздигинин багытына таасир этиши мүмкүн39,46,59. GA тарабынан индукцияланган механикалык стресстин жана GA тарабынан микротүтүкчөлөрдүн багытын түздөн-түз жөнгө салуунун айкалышкан таасири түйүндөр аралык түйүндөрдү аныктоо үчүн IPRде клетканын бөлүнүү багытынын белгилүү бир үлгүсүн түзүүгө катышышы мүмкүн жана бул идеяны текшерүү үчүн андан ары изилдөөлөр талап кылынат. Ошо сыяктуу эле, мурунку изилдөөлөр түйүндөр аралык түзүлүштү көзөмөлдөөдө DELLA менен өз ара аракеттенүүчү TCP14 жана 15 белокторунун маанисин баса белгилеген60,61 жана бул факторлор түйүндөр аралык өнүгүүнү жөнгө салуучу BREVIPEDICELLUS (BP) жана PENNYWISE (PNY) менен бирге GAнын аракетин ортомчулук кылышы мүмкүн жана GA сигнализациясына таасир этери көрсөтүлгөн2,62. DELLAлар брассиностероид, этилен, жасмон кислотасы жана абсциз кислотасы (ABA) сигнал берүү жолдору менен өз ара аракеттенишерин63,64 жана бул гормондор микротүтүкчөлөрдүн багытына65 таасир эте аларын эске алганда, GAнын клетканын бөлүнүү багытына тийгизген таасири башка гормондор аркылуу да болушу мүмкүн.
Алгачкы цитологиялык изилдөөлөр Arabidopsis SAMнын ички жана тышкы аймактары түйүндөр аралык өнүгүү үчүн зарыл экенин көрсөттү2,42. GA ички ткандардагы клеткалардын бөлүнүшүн активдүү түрдө жөнгө салышы12 SAMдагы меристеманы жана түйүндөр аралык өлчөмүн жөнгө салууда GAнын кош функциясын колдойт. Багытталган клеткалардын бөлүнүү схемасы ички SAM тканында да катуу жөнгө салынат жана бул жөнгө салуу сабактын өсүшү үчүн абдан маанилүү52. GA ошондой эле SAMдын ички уюмунда клеткалардын бөлүнүү тегиздигин багыттоодо, ошону менен SAMдын ичиндеги түйүндөр аралыктардын спецификациясын жана өнүгүшүн синхрондоштурууда роль ойнойбу же жокпу, изилдөө кызыктуу болот.
Өсүмдүктөр in vitro шартында топуракта же 1% сахароза жана 1% агар (Sigma) кошулган 1x Мурашиге-Скуг (MS) чөйрөсүндө (Duchefa) стандарттуу шарттарда (16 саат жарык, 22 °C) өстүрүлдү, гипокотил жана тамыр өстүрүү эксперименттеринен тышкары, көчөттөр туруктуу жарык жана 22 °C астында вертикалдуу плиталарда өстүрүлдү. Нитрат эксперименттери үчүн өсүмдүктөр узак күн шарттарында жетиштүү нитрат (0 же 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцинат, 1% сахароза жана 1% А-агар (Sigma) кошулган модификацияланган MS чөйрөсүндө (bioWORLD өсүмдүк чөйрөсүндө) өстүрүлдү.
pDONR221ге киргизилген GID1a кДНКсы pDONR P4-P1R-pUBQ10 жана pDONR P2R-P3-mCherry менен pB7m34GWге кайра бириктирилип, pUBQ10::GID1a-mCherry пайда болгон. pDONR221ге киргизилген IDD2 ДНКсы p35S:IDD2-RFP пайда кылуу үчүн pB7RWG266га кайра бириктирилген. pGID1b::2xmTQ2-GID1b түзүү үчүн, GID1b коддоо аймагынын жогору жагындагы 3,9 кб фрагмент жана GID1b кДНКсын (1,3 кб) жана терминаторду (3,4 кб) камтыган 4,7 кб фрагмент алгач 3-кошумча таблицадагы праймерлерди колдонуу менен күчөтүлүп, андан кийин тиешелүүлүгүнө жараша pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) жана pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ичине киргизилип, акырында Gateway клондоштуруусун колдонуп, pDONR221 2xmTQ268 менен pGreen 012567 максаттуу векторуна рекомбинацияланган. pCUC2::LSSmOrange түзүү үчүн, CUC2 промотор ырааттуулугу (ATGден жогору 3229 bp), андан кийин N7 ядролук локализация сигналы жана NOS транскрипциялык терминатору бар чоң Стокс-жылышкан mOrange (LSSmOrange)69 коддоо ырааттуулугу Gateway 3-фрагменттик рекомбинация системасы (Invitrogen) аркылуу pGreen канамицинди максаттуу векторго чогултулган. Өсүмдүктүн экилик вектору Agrobacterium tumefaciens GV3101 штаммына киргизилген жана Agrobacterium инфильтрация ыкмасы менен Nicotiana benthamiana жалбырактарына жана Arabidopsis thaliana Col-0го гүлдүү чөмүлтүү ыкмасы менен киргизилген. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry жана pCLV3::mCherry-NLS qmRGA тиешелүү кайчылашуулардын F3 жана F1 тукумдарынан тиешелүү түрдө бөлүнүп алынган.
РНК in situ гибриддештирүү болжол менен 1 см узундуктагы өрүк учтарында жүргүзүлдү72, алар чогултулуп, дароо 4°C чейин муздатылган FAA эритмесине (3,7% формальдегид, 5% уксус кислотасы, 50% этанол) бекитилди. 2 × 15 мүнөттүк вакуумдук иштетүүдөн кийин, фиксатор алмаштырылып, үлгүлөр түнү бою инкубацияланды. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 жана RGL3 кДНКлары жана алардын 3′-UTRлерине антисенс зонддору Розье жана башкалар тарабынан сүрөттөлгөндөй, 3-кошумча таблицада көрсөтүлгөн праймерлерди колдонуу менен синтезделген73. Дигоксигенин менен белгиленген зонддор дигоксигенин антителолорун колдонуу менен иммундук детекцияланган (3000 эсе суюлтуу; Roche, каталог номери: 11 093 274 910), ал эми кесиндилер 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP, 250 эсе суюлтуу)/нитроблюк тетразолий (NBT, 200 эсе суюлтуу) эритмеси менен боёлгон.
Жарыяланган убактысы: 2025-жылдын 10-февралы