Октун апикалдык меристемасынын (SAM) өсүшү сабактын архитектурасы үчүн абдан маанилүү. Өсүмдүк гормондоругиббереллиндер(ГАлар) өсүмдүктөрдүн өсүшүн координациялоодо негизги ролду ойнойт, бирок алардын SAMдагы ролу начар түшүнүлөт. Бул жерде биз DELLA протеининин GA транскрипциялык реакциясында анын маанилүү жөнгө салуучу функциясын басуу үчүн инженериялоо жолу менен GA сигнализациясынын рационометрикалык биосенсорун иштеп чыктык, ал эми GA таанууда анын бузулушун сактайт. Биз бул деградацияга негизделген биосенсор GA деңгээлиндеги өзгөрүүлөрдү жана өнүгүү учурунда уюлдук сезүүнү так жазаарын көрсөтөбүз. Биз бул биосенсорду SAMдагы GA сигналдык активдүүлүгүн картага түшүрүү үчүн колдондук. Биз жогорку GA сигналдары негизинен ички клеткалардын прекурсорлору болгон орган примордияларынын ортосунда жайгашкан клеткаларда бар экенин көрсөтөбүз. Функцияны пайда кылуу жана жоготуу ыкмаларын колдонуу менен, биз андан ары GA клетканын бөлүнүү тегиздигинин багытын жөнгө салып, түйүндөр аралыктардын канондук уюлдук уюмун түзөрүн, ошону менен SAMда түйүндөр аралык спецификацияны илгерилетээрин көрсөтөбүз.
Өсүмдүктүн апикалдык меристемасы (SAM) бүчүрүнүн чокусунда жайгашкан өзөк клеткаларынын уясын камтыйт, алардын иш-аракети өсүмдүктүн бүткүл өмүрүндө модулдук жана итеративдик түрдө каптал органдарды жана өзөк бездерин пайда кылат. Бул кайталануучу бирдиктердин, же өсүмдүк түйүндөрүнүн ар бири түйүндөрүндө түйүн аралык жана каптал органдарды, ал эми жалбырак колтуктарында колтуктук меристемаларды камтыйт1. Өсүмдүк түйүндөрүнүн өсүшү жана уюштурулушу өнүгүү учурунда өзгөрөт. Арабидопсисте вегетативдик стадияда түйүн аралык өсүү басылып, колтуктук меристемалар розетка жалбырактарынын колтугунда уктап калат. Флоралык фазага өтүү учурунда САМ гүлдөө меристемасына айланып, узарган түйүн аралык жана колтук бүчүрлөрүн, каулин жалбырактарынын колтугунда бутакчаларды, кийинчерээк жалбыраксыз гүлдөрдү пайда кылат2. Биз жалбырактардын, гүлдөрдүн жана бутактардын башталышын көзөмөлдөгөн механизмдерди түшүнүүдө олуттуу ийгиликтерге жетиштик, бирок интерноддор кантип пайда болоору жөнүндө салыштырмалуу аз белгилүү.
ГАнын мейкиндик-убакыттык бөлүштүрүлүшүн түшүнүү бул гормондордун ар кандай кыртыштарда жана өнүгүүнүн ар кандай этаптарында функцияларын жакшыраак түшүнүүгө жардам берет. RGA-GFP синтезинин деградациясынын визуализациясы өзүнүн промоутеринин иш-аракети астында чагылдырылган тамырларда жалпы GA деңгээлин жөнгө салуу боюнча маанилүү маалыматты берет15,16. Бирок, RGA экспрессиясы кыртыштарда17 өзгөрүп турат жана GA18 тарабынан жөнгө салынат. Ошентип, RGA промоутордун дифференциалдык туюнтмасы RGA-GFP менен байкалган флуоресценция үлгүсүнө алып келиши мүмкүн, ошондуктан бул ыкма сандык эмес. Жакында биоактивдүү флуоресцеин (Fl) менен белгиленген GA19,20 тамырдын эндокортексинде GA топтолушун жана анын клеткалык деңгээлдерин GA транспорту менен жөнгө салгандыгын аныктады. Жакында GA FRET сенсору nlsGPS1 GA деңгээли тамырлардагы, жипчелердеги жана караңгы өскөн гипокотилдерде21 клетканын узартылышы менен байланышта экенин көрсөттү. Бирок, биз көрүп тургандай, GA концентрациясы GA сигналдык активдүүлүгүн башкарган жалгыз параметр эмес, анткени ал татаал сезүү процесстеринен көз каранды. Бул жерде, DELLA жана GA сигнал берүү жолдору жөнүндөгү түшүнүгүбүзгө таянып, биз GA сигнализациясы үчүн деградацияга негизделген рациондук биосенсорду иштеп чыгуу жана мүнөздөмө берүү жөнүндө кабарлайбыз. Бул сандык биосенсорду иштеп чыгуу үчүн биз флуоресценттик протеинге кошулган жана бардык жерде ткандарда экспрессияланган мутант GA сезгич RGAны, ошондой эле GA сезгич эмес флуоресценттик протеинди колдондук. Биз мутант RGA протеининин биригүүлөрү бардык жерде айтылганда эндогендик GA сигнализациясына тоскоолдук кылбасын жана бул биосенсор GA киришинен жана GA сигналын иштетүүдөн келип чыккан сигналдык активдүүлүктү мейкиндиктин жогорку резолюциясы менен сезүү аппараты тарабынан сандык аныктай аларын көрсөтөбүз. Биз бул биосенсорду GA сигналдык активдүүлүгүнүн мейкиндик-убакыт бөлүштүрүүнүн картасын жана GA SAM эпидермисиндеги уюлдук жүрүм-турумду кантип жөнгө салаарын сандык аныктоо үчүн колдондук. Биз GA орган примордияларынын ортосунда жайгашкан SAM клеткаларынын бөлүнүү тегиздигинин багытын жөнгө салып, ошону менен түйүн аралыктын канондук уюлдук уюмун аныктай турганын көрсөтөбүз.
Акыр-аягы, биз qmRGA өсүп жаткан hypocotyls колдонуп эндогендик GA денгээлде өзгөрүүлөрдү кабарлай алабы деп сурады. Биз буга чейин нитрат GA синтезин жана өз кезегинде DELLA34 деградациясын жогорулатуу менен өсүштү стимулдай турганын көрсөткөн. Демек, биз нитраттын мол шартында өстүрүлгөн pUBQ10 :: qmRGA көчөттөрүндөгү гипокотилдин узундугу (10 mM NO3−) нитрат жетишсиз шарттарда өстүрүлгөн көчөттөрдөгүгө караганда бир кыйла узун экенин байкадык (Кошумча сүрөт 6a). Өсүү реакциясына ылайык, 10 мМ NO3− шартында өстүрүлгөн көчөттөрдүн гипокотилдеринде GA сигналдары нитрат жок жерде өстүрүлгөн көчөткө караганда жогору болгон (Кошумча сүрөт 6b, c). Ошентип, qmRGA ошондой эле GA концентрациясынын эндогендик өзгөрүүлөрү менен шартталган GA сигналындагы өзгөрүүлөргө мониторинг жүргүзүүгө мүмкүндүк берет.
QmRGA тарабынан аныкталган GA сигналдык активдүүлүгү GA концентрациясына жана GA кабылдоосуна көз карандыбы же жокпу, түшүнүү үчүн, сенсордун дизайнынын негизинде күтүлгөндөй, биз вегетативдик жана репродуктивдүү ткандардагы үч GID1 рецепторунун экспрессиясын талдадык. Көчөттөрдөгү GID1-GUS кабарчы сызыгы GID1a жана с котилдендерде жогору экенин көрсөттү (сүрөт 3a–c). Мындан тышкары, бардык үч кабылдагычтар жалбырактарда, каптал тамыр примордиясында, тамыр учтарында (GID1b тамыр капкагын кошпогондо) жана кан тамыр системасында (сүрөт 3a–c) чагылдырылган. SAM гүлдөөсүндө биз GID1b жана 1c үчүн гана GUS сигналдарын таптык (Кошумча 7a–c сүрөт). In situ гибриддештирүү бул экспрессия үлгүлөрүн тастыктады жана андан ары GID1c SAMда төмөн деңгээлде бир калыпта туюндурулганын көрсөттү, ал эми GID1b SAMдын четинде жогорураак экспрессияны көрсөттү (Кошумча сүрөт 7d-l). pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b котормо синтези ошондой эле GID1b экспрессиясынын даражалуу диапазонун ачып берди, SAMдын борборундагы төмөн же такыр экспрессиядан органдын чектериндеги жогорку экспрессияга чейин (Кошумча сүрөт 7m). Ошентип, GID1 кабылдагычтар бир калыпта жана кыртыштарда бөлүштүрүлгөн эмес. Кийинки эксперименттерде биз GID1дин ашыкча экспрессиясы (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) гипокотилдерде qmRGAнын тышкы GA колдонмосуна сезгичтигин жогорулатканын байкадык (сүрөт 3d, e). Ал эми, гипокотилдеги qd17mRGA менен өлчөнгөн флуоресценция GA3 дарылоого сезгич эмес болгон (сүрөт 3f, g). Эки анализ үчүн көчөттөр сенсордун тез жүрүм-турумун баалоо үчүн GA (100 μM GA3) жогорку концентрациялары менен дарыланган, ал жерде GID1 кабылдагыч менен байланышуу жөндөмдүүлүгү жогорулаган же жоголгон. Бул жыйынтыктар qmRGA биосенсору GA жана GA сенсору катары бириккен функцияны аткарарын тастыктайт жана GID1 рецепторунун дифференциалдык экспрессиясы сенсордун эмиссивдүүлүгүн олуттуу модуляциялай алат деп болжолдойт.
Бүгүнкү күнгө чейин, SAMда GA сигналдарынын бөлүштүрүлүшү бүдөмүк бойдон калууда. Ошондуктан, биз L1 катмарына (эпидермис; 4a, б-сүрөт, Методдорду жана кошумча методдорду караңыз) көңүл буруп, GA сигналдык активдүүлүгүнүн жогорку резолюциялуу сандык карталарын эсептөө үчүн qmRGA-экспрессиялоочу өсүмдүктөрдү жана pCLV3::mCherry-NLS өзөк клеткасынын кабарчысын35 колдондук. Бул жерде, pCLV3 :: mCherry-NLS туюнтмасы GA сигналдык активдүүлүгүнүн мейкиндик-убакыттык бөлүштүрүлүшүн талдоо үчүн туруктуу геометриялык таяныч пунктун берди. GA каптал органдын өнүгүшү үчүн маанилүү деп эсептелгенине карабастан, биз GA сигналдары гүлдүү примордиумда (P) P3 баскычынан баштап төмөн болгонун байкадык (сүрөт 4a, б), ал эми жаш P1 жана P2 примордиумдары борбордук аймактагыдай орточо активдүүлүккө ээ (сүрөт 4a, б). Жогорку GA сигналдык активдүүлүгү органдын примордиумунун чектеринде, P1/P2ден (чек аранын капталдарында) башталып, P4 чегинде, ошондой эле примордиялардын ортосунда жайгашкан перифериялык аймактын бардык клеткаларында аныкталган (сүрөт 4a, b жана кошумча сүрөт 8a, b). Бул жогорку GA сигналдык активдүүлүгү эпидермисте гана эмес, L2 жана жогорку L3 катмарларында да байкалган (Кошумча фиг. 8b). SAMда qmRGA аркылуу аныкталган GA сигналдарынын үлгүсү да убакыттын өтүшү менен өзгөрүүсүз калган (Кошумча сүрөт 8c-f, k). Qd17mRGA конструкциясы T3 өсүмдүктөрүнүн SAMинде биз майда-чүйдөсүнө чейин мүнөздөгөн беш көз карандысыз линиядан системалуу түрдө төмөндөтүлгөн болсо да, биз pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP конструкциясы менен алынган флуоресценция үлгүлөрүн талдай алдык (Кошумча сүрөт 8g – j, l). Бул башкаруу линиясында SAMда флуоресценттик катышта бир аз гана өзгөрүүлөр аныкталган, бирок SAM борборунда биз TagBFP менен байланышкан VENUSдун ачык жана күтүүсүз төмөндөшүн байкадык. Бул qmRGA тарабынан байкалган сигнализация үлгүсү mRGA-VENUSдун GAга көз каранды деградациясын чагылдырарын ырастайт, бирок qmRGA меристема борборундагы GA сигнализация активдүүлүгүн ашыкча баалашы мүмкүн экенин көрсөтөт. Кыскача айтканда, биздин натыйжалар биринчи кезекте примордианын бөлүштүрүлүшүн чагылдырган GA сигналдык үлгүсүн ачып берет. Алгачкы чөлкөмдүн (IPR) мындай бөлүштүрүлүшү өнүгүп келе жаткан примордиум менен борбордук аймактын ортосунда ГА сигналдык активдүүлүгүнүн акырындык менен орношу менен шартталган, ошол эле учурда примордиумдагы ГА сигналдык активдүүлүгү төмөндөйт (сүрөт 4в, г).
GID1b жана GID1c рецепторлорунун бөлүштүрүлүшү (жогоруда караңыз) GA рецепторлорунун дифференциалдык экспрессиясы SAMдагы GA сигналдык активдүүлүгүнүн үлгүсүн калыптандырууга жардам берет деп болжолдойт. ГАнын дифференциалдык топтолушу катышышы мүмкүнбү деп ойлодук. Бул мүмкүнчүлүктү изилдөө үчүн биз nlsGPS1 GA FRET сенсор21 колдондук. 100 мүнөткө 10 μM GA4+7 менен иштетилген nlsGPS1 SAMда активдештирүү жыштыгынын жогорулашы аныкталды (Кошумча 9a–e сүрөт), бул nlsGPS1 тамырлардагыдай эле SAMдагы GA концентрациясынын өзгөрүшүнө жооп берерин көрсөтүп турат21. NlsGPS1 активдештирүү жыштыгынын мейкиндикте бөлүштүрүлүшү SAMдын сырткы катмарларында салыштырмалуу төмөн GA деңгээлин аныктады, бирок алар SAMдын борборунда жана чектеринде көтөрүлгөндүгүн көрсөттү (сүрөт 4e жана Кошумча фиг. 9a,c). Бул GA да SAMда qmRGA ачып бергенге окшош мейкиндик схемасы менен бөлүштүрүлгөнүн көрсөтүп турат. Кошумча ыкма катары биз SAMга флуоресценттүү GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) же Fl жалгыз терс башкаруу катары мамиле кылдык. Fl сигналы азыраак интенсивдүүлүктө болсо да, борбордук аймакты жана примордиумду кошкондо, SAM боюнча бөлүштүрүлдү (4j-сүрөт жана Кошумча сүрөт 10d). Ал эми, үч GA-Fl тең өзгөчө примордиум чектеринде жана IPRдын калган бөлүгүндө ар кандай даражада топтолгон, GA7-Fl IPRдагы эң чоң доменде топтолот (4k-сүрөт жана Кошумча фиг. 10a,b). Флуоресценциянын интенсивдүүлүгүн сандык аныктоо IPR менен IPR эмес интенсивдүүлүктүн катышы GA-Fl менен иштетилген SAMда Fl менен иштетилген SAMга салыштырмалуу жогору экенин көрсөттү (4л-сүрөт жана Кошумча 10c-сүрөт). Бул жыйынтыктар менен бирге, GA органдын чек арасына жакын жайгашкан IPR клеткаларында жогорку концентрацияда бар экенин көрсөтүп турат. Бул SAM GA сигналдык активдүүлүгүнүн үлгүсү GA рецепторлорунун дифференциалдык экспрессиясынан жана орган чектерине жакын IPR клеткаларында GA дифференциалдык топтолушунан келип чыккандыгын көрсөтүп турат. Ошентип, биздин талдоо GA сигнализациясынын күтүлбөгөн мейкиндик-убакыт моделин ачып берди, анын борборунда жана SAM примордиумунда төмөнкү активдүүлүк жана перифериялык аймакта IPRда активдүүлүк жогору.
SAMдагы дифференциалдык GA сигналдык активдүүлүгүнүн ролун түшүнүү үчүн, биз SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLSтин реалдуу убакыт режиминдеги сүрөтүн колдонуу менен GA сигнализация активдүүлүгү, клетканын кеңейүүсү жана клетканын бөлүнүшүнүн ортосундагы корреляцияны талдадык. Өсүүнү жөнгө салууда GA ролун эске алуу менен, клетканын кеңейүү параметрлери менен оң корреляция күтүлгөн. Ошондуктан, биз адегенде GA сигналдык активдүүлүк карталарын клетка бетинин өсүү ылдамдыгынын карталары менен салыштырдык (белгилүү бир клетка үчүн жана бөлүнүү учурунда клетканын кеңейүү күчү үчүн прокси катары) жана клетканын кеңейүү багытын өлчөй турган өсүү анизотропиясынын карталары менен (бул жерде ошондой эле берилген клетка үчүн жана бөлүнүү учурундагы кыз клеткалар үчүн колдонулат; 5a-сүрөт, Метод жана кошумчаларды караңыз). Биздин SAM клетка бетинин өсүү темпинин карталары мурунку байкоолор38,39 менен шайкеш келет, чек арадагы минималдуу өсүү темптери жана өнүгүп келе жаткан гүлдөрдүн максималдуу өсүү темптери менен (сүрөт 5а). Негизги компоненттерди талдоо (PCA) GA сигналдык активдүүлүгү клетка бетинин өсүү интенсивдүүлүгү менен терс байланышта экенин көрсөттү (Figure 5c). Биз ошондой эле негизги өзгөрүү октору, анын ичинде GA сигнализациясы жана өсүү интенсивдүүлүгү, жогорку CLV3 туюнтмасы менен аныкталган багытка ортогоналдык экендигин көрсөттүк, бул калган анализдерде SAM борборунан клеткалардын чыгарылышын ырастады. Спирмендин корреляциялык анализи PCA натыйжаларын тастыктады (Figure 5d), бул IPRдагы жогорку GA сигналдары клетканын кеңейишине алып келбегенин көрсөтүп турат. Бирок, корреляциялык анализ GA сигналдык активдүүлүгү менен өсүү анизотропиясынын ортосунда бир аз оң корреляцияны көрсөттү (Figure 5c, d), IPRдагы жогорку GA сигнализациясы клетканын өсүү багытына жана, балким, клетканын бөлүнүү тегиздигинин абалына таасир этет деп болжолдойт.
a, b САМдагы орточо беттик өсүштүн (а) жана өсүү анизотропиясынын (б) жылуулук карталары жети көз карандысыз өсүмдүктөрдүн орточо маанисин (клетканын кеңейүү күчү жана багыты үчүн прокси катары колдонулат). с PCA талдоо төмөнкү өзгөрмөлөрдү камтыган: GA сигнал, беттик өсүү интенсивдүүлүгү, беттик өсүш анизотропия жана CLV3 билдирүү. PCA компоненти 1 негизинен үстүнкү өсүү интенсивдүүлүгү менен терс корреляцияланган жана GA сигналы менен оң байланышта болгон. PCA компоненти 2 негизинен беттик өсүш анизотропия менен оң корреляцияланган жана CLV3 билдирүүсү менен терс корреляцияланган. Проценттер ар бир компонент менен түшүндүрүлгөн вариацияны билдирет. г CZ кошпогондо кыртыш масштабында GA сигнал, үстүнкү өсүү интенсивдүүлүгү жана беттик өсүш анизотропия ортосундагы Spearman корреляциялык талдоо. Оң жактагы сан эки өзгөрмөнүн ортосундагы Spearman rho мааниси. Жылдызчалар корреляция/терс корреляция өтө маанилүү болгон учурларды көрсөтөт. e Col-0 SAM L1 клеткаларынын конфокалдык микроскопиялык 3D визуализациясы. 10 саатта SAMда (бирок примордиумда эмес) пайда болгон жаңы клетка дубалдары бурчтун маанилерине ылайык түскө ээ. Түс тилкеси төмөнкү оң бурчта көрсөтүлгөн. Кыстарма 0 саатта тиешелүү 3D сүрөттү көрсөтөт. Окшош натыйжалар менен эксперимент эки жолу кайталанды. f кутуча участоктору IPR жана IPR эмес Col-0 SAM (n = 10 көз карандысыз өсүмдүк) клеткалардын бөлүнүү ылдамдыгын көрсөтөт. Борбордук сызык медиананы, ал эми кутучанын чек аралары 25 жана 75-проценттильдерди көрсөтөт. Баурайлар R программасы менен аныкталган минималдуу жана максималдуу маанилерди көрсөтөт. P маанилери Welchтин эки куйруктуу t-тест менен алынган. g, h Схематикалык диаграмма (g) жаңы клетка дубалынын бурчун кантип өлчөө керек (кызыл) SAM борборунан радиалдык багытка карата (ак чекиттүү сызык) (курч бурчтун маанилери, б.а. 0–90° гана каралат) жана (h) меристеманын ичиндеги айлана/каптал жана радиалдык багыттар. i Тиешелүүлүгүнө жараша SAM (кара көк), IPR (орто көк) жана IPR эмес (ачык көк) боюнча клетканын бөлүнүү тегиздигинин жыштык гистограммалары. P маанилери эки куйруктуу Колмогоров-Смирнов тести менен алынган. Окшош натыйжалар менен эксперимент эки жолу кайталанды. j P3 (ачык жашыл), P4 (орто жашыл) жана P5 (кочкул жашыл) айланасында IPRдын клетканын бөлүнүү тегиздигинин жыштык гистограммалары. P маанилери эки куйруктуу Колмогоров-Смирнов тести менен алынган. Окшош натыйжалар менен эксперимент эки жолу кайталанды.
Ошондуктан, биз кийинки анализ учурунда жаңы пайда болгон клетка дубалдарын аныктоо менен GA сигнализациясы менен клетканын бөлүнүү активдүүлүгүнүн ортосундагы корреляцияны изилдедик (сүрөт 5e). Бул ыкма клетканын бөлүнүшүнүн жыштыгын жана багытын өлчөөгө мүмкүндүк берди. Таң калыштуусу, биз IPRдагы клетка бөлүнүштөрүнүн жыштыгы жана SAMдын калган бөлүгү (IPR эмес, 5f) окшош экендигин таптык, бул IPR жана IPR эмес клеткалардын ортосундагы GA сигналындагы айырмачылыктар клетканын бөлүнүшүнө олуттуу таасир этпейт. Бул жана GA сигнализациясы менен өсүү анизотропиясынын ортосундагы оң корреляция бизди GA сигналдык активдүүлүгү клетканын бөлүнүү тегиздигинин багыттоосуна таасир эте алабы же жокпу деген маселени кароого түрткү берди. Биз меристеманын борборун жана жаңы клетка дубалынын борборун (сүрөт 5e-i) туташтырган радиалдык огуна салыштырмалуу курч бурч катары жаңы клетка дубалынын багытын ченедик жана клеткалардын радиалдык огуна салыштырмалуу 90 ° жакын бурчта бөлүнүү тенденциясын байкадык. (22,62%) (сүрөт 5e, i), айлана-тегерек / туурасынан кеткен багытта клетка бөлүнүшүнө туура келет (сүрөт 5h). Бул клетка бөлүнүү жүрүм-турумуна GA сигнал салымын изилдөө үчүн, биз IPR жана эмес IPR өзүнчө клетка бөлүнүү параметрлерин талдоо (сүрөт. 5i). Биз IPR клеткаларындагы бөлүнүү бурчунун бөлүштүрүлүшү IPR эмес клеткалардан же бүтүндөй SAMдагы клеткалардан айырмаланганын байкадык, IPR клеткалары каптал/айланма клетка бөлүнүштөрүнүн көбүрөөк үлүшүн, башкача айтканда, 70-80° жана 80-90° (33.86% жана 30.71% (тиешелүү түрдө) Fig5). Ошентип, биздин байкоолор GA сигнал жигердүүлүгү жана өсүү анизотропия (сүрөт. 5c, г) ортосундагы корреляцияга окшош айлана багытка жакын жогорку GA сигнал жана клетка бөлүнүү тегиздик багыты ортосундагы байланышты ачып берди. Бул бирикменин мейкиндик сакталышын андан ары түзүү үчүн, биз P3 баштап примордиумду курчап турган IPR клеткаларындагы бөлүнүү тегиздигинин багытын ченедик, анткени бул аймакта P4 баштап эң жогорку GA сигнал активдүүлүгү аныкталган (4-сүрөт). P3 жана P4 айланасында IPRдын бөлүнүү бурчтары статистикалык жактан маанилүү айырмачылыктарды көрсөткөн жок, бирок P4 айланасындагы IPRда каптал клеткалардын бөлүнүү жыштыгы байкалган (сүрөт 5j). Бирок Р5 айланасындагы IPR клеткаларында клетканын бөлүнүү тегиздигинин ориентациясынын айырмасы статистикалык мааниге ээ болуп, клетканын туурасынан бөлүнүшүнүн жыштыгы кескин өскөн (5j-сүрөт). Биргелешип, бул жыйынтыктар GA сигнализациясы SAMдагы клетка бөлүнүштөрүнүн багытын көзөмөлдөй аларын көрсөтүп турат, бул жогорку GA сигнализациясы IPRдагы клетка бөлүнүштөрүнүн каптал багытын түртүшү мүмкүн деген мурунку отчетторго 40,41 шайкеш келет.
Бул IPRдагы клеткалар примордияга эмес, интерноддорго кошулат деп болжолдонууда2,42,43. IPRдагы клетка бөлүнүштөрүнүн туурасынан кеткен багыты түйүндөрдөгү эпидермис клеткаларынын параллелдүү узунунан кеткен катарларын типтүү уюштурууга алып келиши мүмкүн. Жогоруда сүрөттөлгөн биздин байкоолор GA сигнал, кыязы, клетка бөлүнүү багытын жөнгө салуу менен бул жараянда бир ролду ойнойт деп ойлойм.
Бир нече DELLA генинин функциясынын жоголушу конститутивдүү GA реакциясына алып келет жана делла мутанттары бул гипотезаны текшерүү үчүн колдонулушу мүмкүн44. Биз алгач SAMдагы беш DELLA генинин экспрессия үлгүлөрүн талдадык. GUS линиясынын45 транскрипциялык биригүүсүндө GAI, RGA, RGL1 жана RGL2 (азыраак даражада) SAMда туюндурулганын көрсөттү (Кошумча сүрөт 11a–d). In situ гибриддештирүү андан ары GAI mRNA өзгөчө примордияда жана өнүгүп келе жаткан гүлдөрдө топтолорун көрсөттү (Кошумча сүрөт 11e). RGL1 жана RGL3 mRNA SAM чатырында жана улгайган гүлдөрдөн табылган, ал эми RGL2 mRNA чек ара аймагында көбүрөөк болгон (Кошумча сүрөт 11f-h). pRGL3 :: RGL3-GFP SAMдын конфокалдык сүрөтү in situ гибриддештирүү жолу менен байкалган экспрессияны тастыктады жана RGL3 протеини SAMдын борбордук бөлүгүндө чогулуп турганын көрсөттү (Кошумча сүрөт 11i). pRGA :: GFP-RGA линиясын колдонуу менен биз RGA протеининин SAMда чогулуп турганын да таптык, бирок анын көптүгү P4 тартып чек арада азаят (Кошумча сүрөт 11j). Белгилей кетчү нерсе, RGL3 жана RGA экспрессия үлгүлөрү qmRGA тарабынан аныкталгандай, IPRдагы жогорку GA сигналдык активдүүлүгүнө шайкеш келет (4-сүрөт). Мындан тышкары, бул маалыматтар бардык DELLAлар SAMда чагылдырылганын жана алардын туюнтмалары жалпы SAMды камтыйт.
Андан кийин биз жапайы типтеги SAM (Ler, контроль) жана gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 делла бешинчи (глобалдык) мутанттардагы клетканын бөлүнүү параметрлерин талдадык (сүрөт 6а, б). Кызыктуусу, биз жапайы түрү менен салыштырганда делла глобалдык мутант SAM клетка бөлүнүү бурч жыштыктарын бөлүштүрүү статистикалык маанилүү жылыш байкалган (сүрөт. 6c). Делла глобалдык мутанттын бул өзгөрүшү 80-90° бурчтун жыштыгынын көбөйүшүнө (34.71% каршы 24.55%) жана бир аз өлчөмдө 70-80° бурчка (23.78% каршы 20.18%), башкача айтканда, туурасынан кеткен клетка бөлүнүшүнө туура келген (сүрөт 6c). туурасынан кеткен эмес бөлүнүүлөрдүн жыштыгы (0-60 °) ошондой эле делла глобалдык мутант төмөн болгон (сүрөт. 6c). туурасынан кеткен клетка бөлүнүштөрүнүн жыштыгы олуттуу делла глобалдык мутанттын SAM көбөйгөн (сүрөт. 6b). IPR-жылы туурасынан кеткен клетка бөлүнүштөрүнүн жыштыгы жапайы түрү менен салыштырганда делла глобалдык мутант да жогору болгон (сүрөт. 6d). IPR аймагынан тышкары, жапайы тип клетканын бөлүнүү бурчтарынын бир калыпта бөлүштүрүлүшүнө ээ болгон, ал эми делла глобалдык мутант IPR сыяктуу тангенциалдык бөлүнүүнү артык көргөн (сүрөт 6e). Ошондой эле GA топтолгон GA-активдүү эмес мутанттык фон болгон ga2 оксидазасынын (ga2ox) бештик мутанттарынын (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 жана ga2ox6-2) SAMдагы клетка бөлүнүштөрүнүн багытын сандык аныктадык. GA деңгээлинин жогорулашына ылайык, беш ga2ox мутант гүлдөрүнүн SAMы Col-0гө караганда чоңураак болгон (Кошумча 12а, б) жана Col-0 менен салыштырганда, беш ga2ox SAM клетканын бөлүнүү бурчтарынын так башкача бөлүштүрүлүшүн көрсөттү. бөлүмдөр (Кошумча сүрөт 12a–c). Ошентип, биз GA сигнализациясынын конститутивдүү активдешүүсү жана GA топтолушу IPRда жана SAMдын калган бөлүгүндө каптал клеткалардын бөлүнүшүн шарттай турганын көрсөтөбүз.
a, b PI-боюлган L1 катмарынын 3D визуализациясы (а) жана глобалдык делла мутант (б) SAM конфокалдык микроскопиянын жардамы менен. 10 сааттын ичинде SAMда (бирок примордиумда эмес) пайда болгон жаңы клетка дубалдары бурчтун маанилерине ылайык көрсөтүлөт жана түстүү болот. Киргизилгенде SAM 0 саатта көрсөтүлөт. Түс тилкеси төмөнкү оң бурчта көрсөтүлөт. (b) ичиндеги жебе глобалдык делла мутантындагы тегизделген клетка файлдарынын мисалын көрсөтөт. Окшош натыйжалар менен эксперимент эки жолу кайталанды. бүт SAM (d), IPR (e) жана эмес IPR (f) боюнча клетка бөлүнүү тегиздик багыттарынын жыштык бөлүштүрүүнү ce салыштыруу Лер жана глобалдык делла ортосунда. P маанилери эки куйруктуу Колмогоров-Смирнов тестинин жардамы менен алынган. f, Col-0 (i) жана pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) трансгендик өсүмдүктөрдүн PI-боюлган SAM конфокалдык сүрөттөрүнүн 3D визуализациясы. Панелдер (а, б) 10 сааттын ичинде SAMда пайда болгон жаңы клетка дубалдарын (бирок primordia эмес) көрсөтөт. Окшош натыйжалар менен эксперимент эки жолу кайталанды. h–j Col-0 жана pCUC2::gai-1-VENUS өсүмдүктөрүнүн ортосунда бүт SAM (h), IPR (i) жана IPR эмес (j) жайгашкан клетка бөлүнүү тегиздик багыттарынын жыштык бөлүштүрүүнү салыштыруу. P маанилери эки куйруктуу Колмогоров-Смирнов тестинин жардамы менен алынган.
Кийинки биз IPRда GA сигнализациясын бөгөттөөнүн таасирин сынап көрдүк. Ушул максатта, биз VENUS (pCUC2 :: gai-1-VENUS линиясында) бириккен үстөмдүк терс gai-1 белоктун экспрессиясын кууп чыгуу үчүн котиледон чыны 2 (CUC2) промоутерин колдондук. Жапайы типтеги SAMда CUC2 промотору P4 баштап чек ара клеткаларын кошо алганда, SAMдагы көпчүлүк IPRлардын экспрессиясын башкарат жана ушул сыяктуу спецификалык экспрессия pCUC2::gai-1-VENUS өсүмдүктөрүндө байкалган (төмөндө кара). pCUC2 :: gai-1-VENUS өсүмдүктөрүнүн SAM же IPR боюнча клетканын бөлүнүү бурчтарынын бөлүштүрүлүшү жапайы түрдөгүлөрдөн анча деле айырмаланган эмес, бирок күтүлбөгөн жерден биз бул өсүмдүктөрдө IPR жок клеткалар 80-90 ° жогорку жыштыкта бөлүнгөнүн таптык (сүрөт 6f-j).
Клетканын бөлүнүү багыты САМдын геометриясына, атап айтканда кыртыштын ийрилигинен келип чыккан чыңалууга жараша болот деп болжолдонууда46. Ошондуктан биз SAM формасынын della глобалдык мутантында жана pCUC2::gai-1-VENUS өсүмдүктөрүндө өзгөртүлгөнбү деп сурадык. Мурда кабарлангандай12, della глобалдык мутант SAM өлчөмү жапайы түргө караганда чоңураак болгон (Кошумча сүрөт 13a, b, d). CLV3 жана STM РНКнын in situ гибриддештирүү делла мутанттарында меристеманын кеңейүүсүн тастыктады жана андан ары өзөк клеткасынын уясынын каптал кеңейүүсүн көрсөттү (Кошумча 13e, f, h, i). Бирок, SAM ийрилиги эки генотипте тең окшош болгон (Кошумча сүрөт 13k, m, n, p). Биз gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple мутантында жапайы түргө салыштырмалуу ийриликтин өзгөрүүсүз өлчөмүнүн ушундай эле өсүшүн байкадык (Кошумча 13c, d, g, j, l, o, p). Клетканын бөлүнүү багытынын жыштыгы делла төрттүк мутантында да таасир эткен, бирок делла монолиттик мутантына караганда азыраак даражада (Кошумча сүрөт 12d-f). Бул дозалоо эффектиси, ийриликке таасиринин жоктугу менен бирге, Делла төрттүк мутантында калган RGL3 активдүүлүгү DELLA активдүүлүгүнүн жоголушу менен шартталган клетканын бөлүнүү багытындагы өзгөрүүлөрдү чектейт жана клетканын каптал бөлүнүштөрүндөгү өзгөрүүлөр SAM геометриясындагы өзгөрүүлөргө караганда GA сигналдык активдүүлүктүн өзгөрүшүнө жооп катары пайда болот. Жогоруда сүрөттөлгөндөй, CUC2 промотору P4ден баштап SAMдагы IPR экспрессиясын айдайт (Кошумча сүрөт 14a, b) жана тескерисинче, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM кичирейтилген, бирок ийрилиги жогору болгон (Кошумча сүрөт 14c-h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологиясындагы бул өзгөрүү жапайы түргө салыштырмалуу механикалык чыңалуулардын башкача бөлүштүрүлүшүнө алып келиши мүмкүн, мында жогорку айланма стресстер SAM борборунан кыскараак аралыкта башталат47. Же болбосо, pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологиясындагы өзгөрүүлөр трансген экспрессиясынан келип чыккан аймактык механикалык касиеттердин өзгөрүшүнөн келип чыгышы мүмкүн48. Эки учурда тең, бул биздин байкоолорубузду түшүндүрүп, клеткалар айланма / туурасынан кеткен багытта бөлүнүү ыктымалдыгын жогорулатуу менен GA сигналындагы өзгөрүүлөрдүн таасирин жарым-жартылай толтурушу мүмкүн.
Чогуу алганда, биздин маалыматтар жогорку GA сигналдын IPRдагы клетканын бөлүнүү тегиздигинин каптал багытында активдүү роль ойноорун тастыктайт. Алар ошондой эле меристеманын ийрилиги да IPRдагы клетканын бөлүнүү тегиздигинин багытына таасир этээрин көрсөтүп турат.
IPRдагы бөлүнүү тегиздигинин туурасынан ориентациясы, жогорку GA сигналдык активдүүлүгүнөн улам, GA кийинчерээк эпидермис аралык түйүндөрдө табыла турган уюлдук уюмду аныктоо үчүн SAM ичиндеги эпидермистеги радиалдык клетка файлын алдын ала уюштурат деп болжолдойт. Чынында эле, мындай клетка файлдары делла глобалдык мутанттардын SAM сүрөттөрүндө көп көрүнүп турган (сүрөт 6б). Ошентип, SAMдагы GA сигнализациясынын мейкиндик үлгүсүнүн өнүгүү функциясын андан ары изилдөө үчүн, биз жапайы типтеги (Ler жана Col-0), делла глобалдык мутанттарда жана pCUC2 :: gai-1-VENUS трансгендик өсүмдүктөрдө IPRдагы клеткалардын мейкиндик уюмун талдоо үчүн убакыттын өтүшү менен сүрөттү колдондук.
Биз qmRGA IPRдагы GA сигналдык активдүүлүгү P1/P2ден көбөйүп, P4 чокусуна жеткенин жана бул үлгү убакыттын өтүшү менен туруктуу бойдон калганын көрсөттү (сүрөт 4a-f жана Кошумча 8c-f, k). GA сигналынын көбөйүшү менен IPRдагы клеткалардын мейкиндик уюмун талдоо үчүн, биз биринчи байкоодон 34 саат өткөндөн кийин талданган өнүгүү тагдырына ылайык, Ler IPR клеткаларын Р4түн үстүндө жана капталдарына белгиледик, башкача айтканда, экиден ашык пластиддик жолу, бул бизге P1/P2ден P4гө чейинки примордиумдун өнүгүүсүндө IPR клеткаларын ээрчүүгө мүмкүндүк берет. Биз үч түрдүү түстү колдондук: P4 жанындагы примордиумга интеграцияланган клеткалар үчүн сары, IPRда болгондор үчүн жашыл жана эки процесске катышкандар үчүн кызгылт көк (сүрөт 7a–c). t0 (0 ч) учурда P4 алдында IPR клеткаларынын 1-2 катмары көрүнгөн (сүрөт 7а). Күтүлгөндөй, бул клеткалар бөлүнгөндө, алар муну негизинен туурасынан кеткен бөлүнүү тегиздиги аркылуу жасашкан (сүрөт 7a–c). Окшош натыйжалар Col-0 SAM аркылуу алынган (Р3гө басым жасоо, анын чек ара бүктөмдөрү Лердеги P4 сыяктуу), бирок бул генотипте гүлдүн чек арасында пайда болгон бүктөм IPR клеткаларын тезирээк жашырган (7g–i-сүрөт). Ошентип, IPR клеткаларынын бөлүнүү схемасы клеткаларды аралыктардагыдай радиалдык катарларга алдын ала уюштурат. Радиалдык катарлардын уюштурулушу жана IPR клеткаларынын ырааттуу органдардын ортосундагы локализациясы бул клеткалар түйүндөр аралык прогениторлор экенин көрсөтүп турат.
Бул жерде биз GA жана GA рецепторлордун бириктирилген концентрацияларынан келип чыккан GA сигналдык активдүүлүгүн сандык картага түшүрүүгө мүмкүндүк берген рационометрикалык GA сигналдык биосенсорду иштеп чыктык, ошол эле учурда эндогендик сигнал жолдоруна кийлигишүүнү азайтып, ошону менен уюлдук деңгээлде GA функциясы жөнүндө маалымат берет. Ушул максатта, биз DELLA өз ара аракеттенүү өнөктөштөрүн байланыштыруу жөндөмүн жоготкон, бирок GA-индукцияланган протеолизге сезгич бойдон калган DELLA протеининин, mRGA түзүлдү. qmRGA GA деңгээлиндеги экзогендик да, эндогендик да өзгөрүүлөргө жооп берет жана анын динамикалык сезүү касиеттери өнүгүү учурунда GA сигнализациясынын активдүүлүгүндөгү мейкиндик-убакыттык өзгөрүүлөргө баа берүүгө мүмкүндүк берет. qmRGA да абдан ийкемдүү курал болуп саналат, анткени аны экспрессиялоо үчүн колдонулган промоторду (зарыл болсо) өзгөртүү менен ар кандай кыртыштарга ыңгайлаштырса болот жана GA сигналдык жолунун сакталган табиятын жана ангиоспермдеги PFYRE мотивин эске алганда, ал башка түрлөргө өткөрүлүп берилиши мүмкүн22. Ушуга ылайык, күрүчтүн SLR1 DELLA протеининдеги (HYY497AAA) эквиваленттүү мутация да SLR1дин өсүү репрессордук активдүүлүгүн басаңдатып, mRGA23 сыяктуу анын GA-арачылыктуу деградациясын бир аз гана азайтканы көрсөтүлгөн. Белгилей кетсек, Арабидопсисте акыркы изилдөөлөр PFYRE домениндеги (S474L) бир аминокислота мутация RGAнын транскрипциялык активдүүлүгүн анын транскрипция факторлорунун өнөктөштөрү менен өз ара аракеттенүү жөндөмүнө таасирин тийгизбестен өзгөрткөнүн көрсөттү50. Бул мутация mRGAдагы 3 аминокислота алмаштырууга абдан жакын болсо да, биздин изилдөөлөр көрсөткөндөй, бул эки мутация DELLAнын айырмаланган мүнөздөмөлөрүн өзгөртөт. Көпчүлүк транскрипция факторунун өнөктөштөрү DELLA26,51дин LHR1 жана SAW домендери менен байланышса да, PFYRE домениндеги кээ бир сакталган аминокислоталар бул өз ара аракеттенүүнү турукташтырууга жардам берет.
Internode өнүктүрүү өсүмдүк архитектурасында жана түшүмдүүлүктү жогорулатуунун негизги өзгөчөлүгү болуп саналат. qmRGA IPR internode прогенитор клеткаларында GA сигналдык активдүүлүгүн көрсөттү. Сандык сүрөттөө жана генетиканы айкалыштыруу менен, биз GA сигналдык үлгүлөрү SAM эпидермисиндеги тегерек / туурасынан кеткен клетка бөлүнүү тегиздиктерин үстүртөн, түйүндөр аралык өнүктүрүү үчүн зарыл болгон клетка бөлүнүү уюмун калыптандырууну көрсөттү. Өнүгүү учурунда клетканын бөлүнүү тегиздигинин багытынын бир нече жөнгө салуучулары аныкталган52,53. Биздин иш бул уюлдук параметрди GA сигналдык активдүүлүгүн кантип жөнгө салгандыгынын ачык мисалын көрсөтөт. DELLA prefolding протеин комплекстери менен өз ара аракеттене алат41, ошондуктан GA сигнализациясы кортикалдык микротюбулалардын ориентациясы40,41,54,55 түздөн-түз таасир этүү аркылуу клетканын бөлүнүү тегиздигинин багытын жөнгө салышы мүмкүн. Биз күтүлбөгөн жерден SAMда жогорку GA сигналдык активдүүлүгүнүн корреляциясы клетканын узартылышы же бөлүнүшү эмес, өсүү анизотропиясы гана экенин көрсөттүк, бул ГАнын IPRдагы клетканын бөлүнүү багытына түз таасирине шайкеш келет. Бирок, биз бул таасир кыйыр түрдө болушу мүмкүн экенин жокко чыгара албайбыз, мисалы, GA-индукцияланган клетка дубалынын жумшартуусу 56. Клетка дубалынын касиеттериндеги өзгөрүүлөр механикалык стрессти пайда кылат57,58, ал ошондой эле кортикалдык микротрубалардын ориентациясына таасир этип, клетканын бөлүнүү тегиздигинин ориентациясына таасир этиши мүмкүн. GA-индукцияланган механикалык стресстин жана микротүтүкчөлөрдүн ориентациясынын GA тарабынан түздөн-түз жөнгө салынышынын биргелешкен эффекттери, интерноддорду аныктоо үчүн IPRда клетканын бөлүнүү ориентациясынын белгилүү бир үлгүсүн түзүүгө тартылышы мүмкүн жана бул идеяны текшерүү үчүн мындан аркы изилдөөлөр керек. Ошо сыяктуу эле, мурунку изилдөөлөр DELLA менен өз ара аракеттенүүчү TCP14 жана 15 белокторунун түйүндөр аралык түзүлүшүн көзөмөлдөөдө маанилүүлүгүн баса белгилешкен 60,61 жана бул факторлор түйүндөр аралык өнүгүүнү жөнгө салуучу BREVIPEDICELLUS (BP) жана PENNYWISE (PNY) менен бирге GA иш-аракетине ортомчулук кылышы мүмкүн жана GA22 сигнализациясына таасир этээри көрсөтүлгөн. DELLAs брассиностероид, этилен, жасмон кислотасы жана абсцисиз кислотасы (ABA) сигналдык жолдору63,64 менен өз ара аракеттенишээрин жана бул гормондор микротүтүкчөлөрдүн ориентациясына65 таасир этиши мүмкүн экенин эске алсак, клетканын бөлүнүшүнө GA таасири башка гормондор аркылуу да болушу мүмкүн.
Алгачкы цитологиялык изилдөөлөр Арабидопсис САМдын ички жана тышкы аймактары internode өнүктүрүү үчүн талап кылынарын көрсөттү2,42. GA ички кыртыштарда клетканын бөлүнүшүн активдүү жөнгө салышы12 САМдагы меристеманы жана түйүндөр аралык өлчөмүн жөнгө салууда ГАнын кош функциясын колдойт. Багыттуу клетка бөлүнүү схемасы да ички SAM кыртышында катуу жөнгө салынат жана бул жөнгө салуу сабактын өсүшү үчүн абдан маанилүү52. GA ошондой эле ички SAM уюмунда клетканын бөлүнүү тегиздигин багыттоодо роль ойноорун, ошону менен SAM ичиндеги интерноддордун спецификациясын жана өнүгүшүн синхрондоштурууну изилдөө кызыктуу болот.
Өсүмдүктөр топуракта in vitro өстүрүлгөн же 1% сахароза жана 1% агар (Сигма) кошулган 1x Murashige-Skoog (MS) чөйрөсүндө (Duchefa) стандарттык шарттарда (16 ч. жарык, 22 °C), көчөттөр туруктуу жарыкта жана 2 °C тик пластинкаларда өстүрүлгөн гипокотил жана тамырдын өсүшү эксперименттеринен тышкары. Нитраттык эксперименттер үчүн өсүмдүктөр адекваттуу нитрат (0 же 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцинат, 1% сахароза жана 1% А-агар (Сигма) менен толукталган өзгөртүлгөн MS чөйрөсүндө (bioWORLD өсүмдүк чөйрөсүндө) өстүрүлгөн.
pDONR221ге киргизилген GID1a cDNA pUBQ10::GID1a-mCherry түзүү үчүн pDONR P4-P1R-pUBQ10 жана pDONR P2R-P3-mCherry менен pB7m34GWге кайра бириктирилди. pDONR221ге киргизилген IDD2 ДНК p35S:IDD2-RFP түзүү үчүн pB7RWG266га кайра бириктирилди. pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b түзүү үчүн, GID1b коддоо чөлкөмүнүн жогору жагындагы 3,9 кб фрагмент жана GID1b cDNA (1,3 кб) жана терминаторду (3,4 кб) камтыган 4,7 кб фрагмент алгач P3-RRдеги праймерлердин жардамы менен күчөтүлгөн жана андан кийин P3-R4P кошулган. (Thermo Fisher Scientific) жана pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) тиешелүүлүгүнө жараша, акырында pDONR221 2xmTQ268 менен Gateway клондоштуруу аркылуу pGreen 012567 максаттуу векторуна рекомбинацияланган. pCUC2::LSSmOrange түзүү үчүн, CUC2 промоутер ырааттуулугу (ATGден 3229 бит жогору), андан кийин N7 ядролук локалдаштыруу сигналы менен чоң Стокс менен жылдырылган mOrange (LSSmOrange)69 коддоо ырааттуулугу жана NOS транскрипциялык терминатору pGreate kancinamy векторунун жардамы менен pGreate frang3 векторунун жардамы менен чогултулган. рекомбинация системасы (Invitrogen). Өсүмдүктүн бинардык вектору Agrobacterium tumefaciens GV3101 штаммына киргизилди жана Nicotiana benthamiana жалбырактарына Agrobacterium инфильтрация ыкмасы менен жана Arabidopsis thaliana Col-0 гүлдөрүнө түшүү ыкмасы менен киргизилди. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry жана pCLV3::mCherry-NLS qmRGA тиешелүү айкаштардын F3 жана F1 тукумдарынан бөлүнүп алынган.
РНК in situ гибриддештирүү болжол менен 1 см узундуктагы бүчүрлөрдүн учтарында аткарылган72, алар чогултулуп, дароо FAA эритмесинде (3,7% формальдегид, 5% уксус кислотасы, 50% этанол) 4 °C чейин муздатылган. 2 × 15 мүнөт вакуумдук дарылоодон кийин, фиксатор алмаштырылып, үлгүлөр түнү менен инкубацияланды. Rosier et al. Дигоксигенин менен белгиленген зонддор дигоксигенин антителолорунун (3000 эсе суюлтуу; Роше, каталогдун номери: 11 093 274 910) жардамы менен иммунодеткацияланган жана бөлүктөрү 5-бром-4-хлоро-3-индолилфосфат (BCIP-5000-2-катталдоо) менен боёлгон. (НБТ, 200 эсе суюлтуу) эритмеси.
Посттун убактысы: 2025-жылдын 10-февралына чейин