Антигельминттик дары N,N-диэтил-м-толуамид (DEET) AChE (ацетилхолинэстераза) ингибирлей турганы жана ашыкча кан тамырлашуудан улам канцерогендик касиетке ээ экени кабарланган. Бул макалада биз DEET ангиогенезди күчөтүүчү эндотелий клеткаларын өзгөчө стимулдай турганын, ошону менен шишиктин өсүшүн күчөтөрүн көрсөтөбүз. DEET ангиогенезге алып келүүчү клеткалык процесстерди, анын ичинде пролиферацияны, миграцияны жана адгезияны активдештирет. Бул эндотелий клеткаларында NO өндүрүшүнүн жана VEGF экспрессиясынын көбөйүшү менен байланыштуу. M3тү басуу же фармакологиялык M3 ингибиторлорун колдонуу бул таасирлердин баарын жокко чыгарып, DEET тарабынан индукцияланган ангиогенез M3кө сезгич экенин көрсөтүп турат. Эндотелий жана HEK клеткаларында кальций сигнализациясын M3 рецепторлорун ашыкча экспрессиялоо менен байланышкан эксперименттер, ошондой эле байланыштыруу жана доктоо изилдөөлөрү DEET M3 рецепторлорунун аллостерикалык модулятору катары иштээрин көрсөтүп турат. Андан тышкары, DEET AChEни ингибирлейт, ошону менен ацетилхолиндин биожеткиликтүүлүгүн жана анын M3 рецепторлоруна байланышын жогорулатат жана аллостерикалык жөнгө салуу аркылуу проангиогендик таасирлерди күчөтөт.
Баштапкы ЭКлар швейцариялык чычкандардын аортасынан бөлүнүп алынган. Экстракция ыкмасы Кобаяши протоколунан 26 алынган. Чычкан ЭКлары төртүнчү өтмөккө чейин 5% жылуулук менен инактивдештирилген FBS кошулган EBM-2 чөйрөсүндө өстүрүлгөн.
HUVEC, U87MG же BF16F10 көбөйүшүнө эки концентрациядагы DEETтин таасири CyQUANT клеткалардын көбөйүшүн анализдөөчү комплект (Molecular Probes, C7026) аркылуу талданды. Кыскача айтканда, ар бир кудукка 5,103 клетка 96 кудуктуу пластинага себилип, түнү бою бекитилип, андан кийин 24 саат бою DEET менен иштетилди. Өстүрүү чөйрөсүн алып салгандан кийин, микропластинанын ар бир кудугуна боёкту байланыштыруучу эритмени кошуп, клеткаларды 37 °C температурада 30 мүнөт инкубациялаңыз. Флуоресценция деңгээли 485 нм дүүлүктүрүүчү чыпкалар жана 530 нм эмиссиялык чыпкалар менен жабдылган Mithras LB940 көп режимдүү микропластина окугучу (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Германия) аркылуу аныкталды.
HUVEC 96 кудуктуу пластиналарга ар бир кудукта 104 клетка тыгыздыгында себилген. Клеткалар 24 саат бою DEET менен иштетилген. Клетканын жашоого жөндөмдүүлүгү колориметриялык MTT анализи (Sigma-Aldrich, M5655) аркылуу бааланган. Оптикалык тыгыздыктын маанилери көп режимдүү микропластина окугучта (Mithras LB940) 570 нм толкун узундугунда алынган.
DEETтин таасири in vitro ангиогенез анализдерин колдонуу менен изилденген. 10-8 M же 10-5 M DEET менен дарылоо HUVECтерде капиллярлардын узундугунун пайда болушун көбөйткөн (1a, b сүрөттөрү, ак тилкелер). Контролдук топ менен салыштырганда, 10-14төн 10-5 Mге чейинки DEET концентрациясы менен дарылоо капиллярлардын узундугу 10-8 M DEETте платого жеткенин көрсөттү (кошумча S2 сүрөтү). 10-8 M жана 10-5 M концентрация диапазонунда DEET менен дарыланган HUVECтердин in vitro проангиогендик таасиринде эч кандай олуттуу айырмачылыктар табылган жок.
DEETтин неоваскуляризацияга тийгизген таасирин аныктоо үчүн биз in vivo неоваскуляризация изилдөөлөрүн жүргүздүк. 14 күндөн кийин, 10-8 M же 10-5 M DEET менен алдын ала өстүрүлгөн эндотелий клеткалары сайылган чычкандарда гемоглобиндин курамынын олуттуу жогорулаганы байкалган (1c-сүрөт, ак тилкелер).
Андан тышкары, DEET менен индукцияланган неоваскуляризация U87MG ксенотрансплантат көтөргөн чычкандарда изилденген, аларга күн сайын (ip) DEET сайылган, ал 10-5 M плазма концентрациясын индукциялай турган дозада берилген, бул адамдарда нормалдуу көрсөткүч. 23. Аныкталуучу шишиктер (б.а. >100 мм3 шишиктер) чычкандарга U87MG клеткаларын сайгандан 14 күн өткөндөн кийин байкалган. 28-күнү DEET менен дарыланган чычкандарда шишиктин өсүшү контролдук чычкандарга салыштырмалуу бир топ жогорулаган (1d-сүрөт, квадраттар). Андан тышкары, шишиктердин CD31 менен боёлушу DEET капиллярлардын аянтын бир топ жогорулаткандыгын, бирок микротамырлар тыгыздыгын эмес экенин көрсөттү (1e–g-сүрөт).
Мускариндик рецепторлордун DETA менен индукцияланган пролиферациядагы ролун аныктоо үчүн, pFHHSiD (10-7 M, тандалма M3 рецепторунун антагонисти) катышуусунда 10-8 M же 10-5 M DETA колдонулган. HUVEC менен дарылоо. pFHHSiD бардык концентрацияларда DETAнын пролиферациялык касиеттерин толугу менен бөгөттөгөн (1-таблица).
Мындай шарттарда биз DEET HUVEC клеткаларында капиллярлардын узундугун көбөйтөбү же жокпу, изилдедик. Ошо сыяктуу эле, pFHHSiD DEET тарабынан индукцияланган капиллярлардын узундугун олуттуу түрдө алдын алган (1a, b-сүрөт, боз тилкелер). Андан тышкары, ушул сыяктуу эксперименттер M3 siRNA менен жүргүзүлгөн. Контролдук siRNA капиллярлардын пайда болушун стимулдаштырууда натыйжалуу болбосо да, M3 мускариндик рецепторун басуу DEETтин капиллярлардын узундугун көбөйтүү жөндөмүн жокко чыгарган (1a, b-сүрөт, кара тилкелер).
Андан тышкары, 10-8 M же 10-5 M DEET менен индукцияланган in vitro кан тамырлашуусу жана in vivo неоваскулярлашуусу pFHHSiD тарабынан толугу менен бөгөттөлдү (1c, d сүрөттөр, тегерекчелер). Бул жыйынтыктар DEETтин селективдүү M3 рецепторунун антагонисттерине же M3 siRNAга сезгич жол аркылуу ангиогенезди стимулдаштыраарын көрсөтүп турат.
AChE DEETтин молекулярдык бутасына кирет. AChE ингибиторлору катары иштеген донепезил сыяктуу дары-дармектер in vitro жана чычкандын арткы буттарынын ишемия моделдеринде EC ангиогенезин стимулдай алат14. Биз HUVECте AChE ферментинин активдүүлүгүнө DEETтин эки концентрациясынын таасирин текшердик. DEETтин төмөн (10-8 M) жана жогорку (10-5 M) концентрациялары контролдук шарттарга салыштырмалуу эндотелий AChE активдүүлүгүн төмөндөттү (2-сүрөт).
DEETтин эки концентрациясынын тең (10-8 M жана 10-5 M) HUVECтеги ацетилхолинэстеразанын активдүүлүгүн төмөндөткөн. BW284c51 (10-5 M) ацетилхолинэстераза ингибиторлору үчүн контролдук катары колдонулган. Жыйынтыктар HUVECтеги DEETтин эки концентрациясы менен дарыланган AChE активдүүлүгүнүн унаа менен дарыланган клеткаларга салыштырмалуу пайызы катары көрсөтүлгөн. Маанилер алты көз карандысыз эксперименттин орточо ± SEM катары көрсөтүлгөн. *p < 0,05 контролдукка салыштырмалуу (Крускал-Уоллис жана Данн көптүк салыштыруу тести).
Азот кычкылы (NO) ангиогендик процессте 33 катышат, ошондуктан DEET менен стимулдаштырылган HUVECтерде NO өндүрүшү изилденген. DEET менен иштетилген эндотелийдеги NO өндүрүшү контролдук клеткаларга салыштырмалуу жогорулаган, бирок мааниси 10-8 М дозасында гана жеткен (3c-сүрөт). DEET менен индукцияланган NO өндүрүшүн көзөмөлдөгөн молекулярдык өзгөрүүлөрдү аныктоо үчүн, eNOS экспрессиясы жана активдешүүсү Вестерн-блоттинг аркылуу талданган. DEET менен дарылоо eNOS экспрессиясын өзгөртпөсө да, ал eNOS фосфорлануусун иштетилбеген клеткаларга салыштырмалуу активдештирүүчү жеринде (Ser-1177) eNOS фосфорлануусун бир кыйла жогорулатып, ал эми ингибирлөөчү жерин (Thr-495) азайткан (3d-сүрөт). Андан тышкары, активдештирүүчү жериндеги жана ингибирлөөчү жериндеги фосфорланган eNOSтун катышы фосфорланган eNOSтун көлөмүн ферменттин жалпы көлөмүнө нормалдаштыргандан кийин эсептелген. Бул катыш DEETтин ар бир концентрациясы менен иштетилген HUVECтерде иштетилбеген клеткаларга салыштырмалуу бир кыйла жогорулаган (3d-сүрөт).
Акырында, негизги проангиогендик факторлордун бири болгон VEGFтин экспрессиясы вестерн-блоттинг аркылуу талданды. DEET VEGF экспрессиясын бир кыйла жогорулатты, ал эми pFHHSiD бул экспрессияны толугу менен бөгөттөп койду.
DEETтин таасири фармакологиялык блокадага жана M3 рецепторлорунун төмөндөшүнө сезгич болгондуктан, биз DEET кальций сигнализациясын күчөтүшү мүмкүн деген гипотезаны текшердик. Таң калыштуусу, DEET колдонулган эки концентрация үчүн тең HUVECте (маалыматтар көрсөтүлгөн эмес) жана HEK/M3тө (4a, b-сүрөт) цитоплазмалык кальцийди көбөйтө алган жок.
Жарыяланган убактысы: 2024-жылдын 30-декабры