Ангельминтик препарат N,N-диэтил-м-толуамид (DEET) AChE (ацетилхолинэстераза) ингибирлейт жана ашыкча васкуляризациядан улам потенциалдуу канцерогендик касиеттерге ээ. Бул макалада биз DEET атайын ангиогенезге көмөктөшүүчү эндотелий клеткаларын стимулдап, ошону менен шишиктин өсүшүн жогорулатаарын көрсөтөбүз. DEET пролиферация, миграция жана адгезияны камтыган ангиогенезге алып баруучу клеткалык процесстерди активдештирет. Бул эндотелий клеткаларында NO өндүрүшүнүн көбөйүшү жана VEGF экспрессиясы менен байланыштуу. M3 унчукпай коюу же фармакологиялык M3 ингибиторлорун колдонуу DEET-индукцияланган ангиогенез M3 сезгич экенин көрсөтүп, бардык бул таасирлерди жокко чыгарды. M3 рецепторлорун ашыкча экспрессациялаган эндотелийдик жана HEK клеткаларында кальций сигнализациясын камтыган эксперименттер, ошондой эле байланыштыруу жана док изилдөөлөр DEET M3 рецепторлорунун аллостерикалык модулятору катары иштээрин көрсөтүп турат. Мындан тышкары, DEET AChE ингибирлейт, ошону менен ацетилхолиндин биожеткиликтүүлүгүн жана анын M3 рецепторлору менен байланышын жогорулатат жана аллостерикалык жөнгө салуу аркылуу проангиогендик эффекттерди күчөтөт.
Негизги ECs швейцариялык чычкандардын аортасынан бөлүнүп алынган. казып алуу ыкмасы Кобаяши протоколуна ылайыкташтырылган 26 . Сычыраган ECs төртүнчү өткөөлгө чейин 5% жылуулук менен иштетилген FBS менен толукталган EBM-2 чөйрөсүндө өстүрүлгөн.
DEETтин эки концентрациясынын HUVEC, U87MG же BF16F10 пролиферациясына тийгизген таасири CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) аркылуу талданды. Кыскача айтканда, ар бир скважинага 5,103 клетка 96 скважинага себилген, түнү бою тиркөөгө уруксат берилген, андан кийин 24 саат бою DEET менен дарыланган. Өсүү чөйрөсүн алып салгандан кийин, микропластинанын ар бир скважинасына боёкту бириктирүүчү эритмени кошуп, клеткаларды 37 °C температурада 30 мүнөткө инкубациялаңыз. Флуоресценция деңгээли 485 нм дүүлүктүрүүчү чыпкалар жана 530 нм эмиссия фильтрлери менен жабдылган Mithras LB940 мультимодулуу микропластинаны окугучтун (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Германия) жардамы менен аныкталган.
HUVEC ар бир скважинага 104 клетканын тыгыздыгы менен 96 скважиналуу пластинкаларга себилген. Клеткалар 24 саат бою DEET менен мамиле кылышкан. Клетканын жашоо жөндөмдүүлүгү колориметрдик MTT анализи (Sigma-Aldrich, M5655) аркылуу бааланган. Оптикалык тыгыздыктын маанилери 570 нм толкун узундугунда мультимодулуу микропластинаны окугучта (Mithras LB940) алынган.
DEET таасирлери in vitro ангиогенез анализдерин колдонуу менен изилденген. 10-8 M же 10-5 M DEET менен дарылоо HUVECs капилляр узундугу пайда көбөйгөн (сүрөт. 1a, б, ак барлар). Контролдук топ менен салыштырганда, 10-14дөн 10-5 Мге чейинки DEET концентрациялары менен дарылоо капиллярдын узундугу 10-8 М DEET платосуна жеткенин көрсөттү (Кошумча S2 сүрөт). 10-8 М жана 10-5 М концентрация диапазонунда DEET менен дарыланган HUVECтердин in vitro проангиогендик таасиринде олуттуу айырма табылган жок.
neovascularization боюнча DEET таасирин аныктоо үчүн, биз in vivo neovascularization изилдөөлөрдү жүргүзгөн. 14 күн өткөндөн кийин, 10-8 M же 10-5 M DEET менен алдын ала өстүрүлгөн эндотелий клеткалары менен сайылган чычкандар гемоглобин мазмунунун олуттуу өсүшүн көрсөттү (сүрөт. 1c, ак барлар).
Андан тышкары, DEET менен шартталган неоваскуляризация U87MG ксеногранттуу чычкандарда изилденген, алар күн сайын (ip) DEET менен 10-5 М плазма концентрациясын индукциялоочу белгилүү дозада сайылган, бул таасирге дуушар болгон адамдарда нормалдуу. жылы 23. Табылган шишиктер (башкача айтканда, шишик >100 мм3) чычкандарга U87MG клеткаларын сайгандан 14 күндөн кийин байкалган. 28 күнү, шишик өсүшү контролдук чычкандар менен салыштырганда DEET менен мамиле чычкандардын бир кыйла жакшырган (сүрөт. 1d, чарчы). Мындан тышкары, шишиктердин CD31 боёгу DEET капиллярлардын аянтын бир кыйла жогорулатканын, бирок микровесселдик тыгыздыкты эмес экенин көрсөттү. (Сүр. 1e–g).
DETA-индукцияланган пролиферацияда мускариндик рецепторлордун ролун аныктоо үчүн pFHHSiD (10-7 M, тандалган M3 рецептор антагонист) катышуусунда 10-8 М же 10-5 М DETA колдонулган. HUVEC дарылоо. pFHHSiD бардык концентрацияларда DETAнын пролиферативдик касиеттерин толугу менен бөгөттөгөн (1-таблица).
Бул шарттарда, биз ошондой эле DEET HUVEC клеткаларында капилляр узундугун көбөйтүүгө болобу, карап чыктык. Ошо сыяктуу эле, pFHHSiD олуттуу DEET-индукцияланган капилляр узундугун алдын алды (сүрөт. 1a, б, боз тилкелер). Мындан тышкары, окшош эксперименттер M3 siRNA менен жасалган. Контролдук siRNA капиллярлардын пайда болушуна көмөктөшүүдө эффективдүү болбосо да, M3 muscarinic рецепторунун унчукпай калышы DEETтин капиллярдын узундугун көбөйтүү мүмкүнчүлүгүн жокко чыгарды (сүрөт. 1a, b, кара тилкелер).
Андан тышкары, 10-8 M же 10-5 M DEET менен шартталган vascularization in vitro жана neovascularization in vivo толугу менен pFHHSiD (сүрөт. 1c, d, чөйрөлөр) бөгөттөлгөн. Бул натыйжалар DEET тандалма M3 рецептор антагонисттерине же M3 siRNAга сезгич жол аркылуу ангиогенезге өбөлгө түзөрүн көрсөтүп турат.
AChE DEETтин молекулярдык максаты болуп саналат. AChE ингибиторлору катары иш-аракет кылган донепезил сыяктуу дарылар in vitro жана чычкандын арткы бутунун ишемиясынын моделдеринде EC ангиогенезин стимулдай алат14. Биз HUVECте DEETтин эки концентрациясынын AChE ферментинин активдүүлүгүнө таасирин сынап көрдүк. Төмөн (10-8 М) жана жогорку (10-5 М) DEET концентрациясы башкаруу шарттарына салыштырмалуу эндотелийдик AChE активдүүлүгүн төмөндөткөн (сүрөт. 2).
DEETтин эки концентрациясы (10-8 М жана 10-5 М) HUVECдеги ацетилхолинэстеразанын активдүүлүгүн азайткан. BW284c51 (10-5 M) acetylcholinesterase ингибиторлору үчүн контролдоо катары колдонулган. Натыйжалар унаа менен иштетилген клеткаларга салыштырмалуу DEETтин эки концентрациясы менен иштетилген HUVEC боюнча AChE активдүүлүгүнүн пайызы катары көрсөтүлөт. Маанилер алты көз карандысыз эксперименттин орточо ± SEM катары көрсөтүлөт. * p < 0,05 контролдоо менен салыштырганда (Kruskal-Wallis жана Dunn көп салыштыруу тест).
Азот кычкылы (NO) ангиогендик процесске катышат 33, ошондуктан, DEET стимулдаштырылган HUVECтерде NO өндүрүшү изилденген. DEET менен мамиле эндотелий NO өндүрүш башкаруу клеткаларына салыштырмалуу көбөйгөн, бирок 10-8 M дозада гана мааниге жеткен (сүрөт. 3c). DEET-индукцияланган NO өндүрүшүн көзөмөлдөгөн молекулярдык өзгөрүүлөрдү аныктоо үчүн eNOS экспрессиясы жана активдештирүү Western blotting менен талданды. DEET дарылоо eNOS экспрессиясын өзгөртпөгөнү менен, анын активдештирүүчү сайтында (Ser-1177) eNOS фосфорлануусун олуттуу көбөйттү, ал эми eNOS phosphorylation менен тазаланбаган клеткаларга салыштырмалуу анын ингибитордук сайтын (Thr-495) азайтты (сүрөт. 3d). Андан тышкары, активдештирүү жана ингибитордук сайттагы фосфорланган eNOS катышы фосфорланган eNOS көлөмүн ферменттин жалпы көлөмүнө нормалдаштыргандан кийин эсептелген. Бул катыш кыйла тазаланбаган клеткаларга салыштырмалуу DEET ар бир концентрациясы менен мамиле HUVECs көбөйгөн (сүрөт. 3d).
Акыр-аягы, VEGF экспрессиясы, негизги proangiogenic себептердин бири, Western Blotting тарабынан талдоого алынган. DEET VEGF экспрессиясын бир топ жогорулатты, ал эми pFHHSiD бул туюнтманы толугу менен бөгөттөгөн.
DEETтин таасири фармакологиялык блокадага жана M3 рецепторлорунун төмөндөшүнө сезгич болгондуктан, биз DEET кальций сигналын күчөтүшү мүмкүн деген гипотезаны сынап көрдүк. Таң калыштуусу, DEET колдонулган эки концентрация үчүн HUVEC (маалыматтар көрсөтүлгөн эмес) жана HEK/M3 (сүрөт. 4a, б) цитоплазмалык кальцийди көбөйтө алган жок.
Посттун убактысы: 2024-жылдын 30-декабрына чейин