Пестициддер глобалдык азык-түлүк жетишсиздигин чечүүдө жана векторлор аркылуу жугуучу адам ооруларына каршы күрөшүүдө маанилүү ролду ойнойт. Бирок, пестициддерге туруктуулуктун өсүп жаткан көйгөйү жетишсиз колдонулган буталарга багытталган жаңы кошулмаларды ачууну тез арада талап кылат. Курт-кумурскалардын өткөөл рецептордук потенциалынын (TRPV) каналдары — Наньчжун (Нан) жана активдүү эмес (Иав) — гетерологиялык каналдарды (Нан-Иав) түзүп, курт-кумурскаларда геотропизмди, угууну жана проприоцепцияны ортомчулук кылган механосенсордук органдарга жайгаша алат. Афидопирролидон (АП) сыяктуу кээ бир пестициддер белгисиз механизмдер аркылуу Нан-Иавды бутага алышат. АП тешип соруп алуучу курт-кумурскаларга (гемиптерандар) каршы натыйжалуу, жипчелердин функциясын бузуу менен тамактанууга жол бербейт. АП Нанга гана байланыша алат, бирок Нан-Иав гана эндогендик никотинамидди (НАМ) кошкондо агонисттер менен өз ара аракеттенип, каналдык активдүүлүктү көрсөтө алат. Нан-Иавдын инсектициддик бута катары потенциалына карабастан, анын каналдык жыйындысы, жөнгө салуучу байланыш жерлери жана Ca2+-көз каранды жөнгө салынышы жөнүндө аз маалымат бар, бул инсектициддердин андан ары өнүгүшүнө тоскоол болот. Бул изилдөөдө крио-электрондук микроскопия Hemiptera курт-кумурскаларындагы Nan-Iav түзүлүшүн кальмодулин-лигандсыз абалда, ошондой эле анкирин кайталоо цитоплазмалык доменинин (ARD) чегинде AP жана NAM менен аныктоо үчүн колдонулган. Таң калыштуусу, биз Nan протеининин өзү пентамер түзө аларын аныктадык, ал AP аркылуу ARD өз ара аракеттенүүсү менен турукташат. Бул изилдөө инсектициддер менен агонисттердин жана Nan-Iavдын ортосундагы молекулярдык өз ара аракеттенүүлөрдү ачып, ARDдин канал функциясындагы жана чогултуудагы маанисин баса белгилеп, Ca2+ жөнгө салуу механизмин изилдейт.
Дүйнөлүк климаттын өзгөрүшүнүн барган сайын күчөп бараткан шартында, глобалдык азык-түлүк коопсуздугунун начарлашы 21-кылымдын негизги көйгөйлөрүнүн бири болуп саналат жана коом үчүн кесепеттерге алып келет.1,2Дүйнөлүк саламаттыкты сактоо уюмунун "Дүйнөдөгү азык-түлүк коопсуздугунун жана тамактануунун абалы 2023" (SOFI) отчетунда дүйнө жүзү боюнча болжол менен 2,33 миллиард адам орточо жана оор азык-түлүк коопсуздугунун жетишсиздигинен жапа чегип жатканы, бул көптөн бери көйгөй жаратып келе жатканы айтылат.3,4Тилекке каршы, жыл сайын түшүмдүн болжол менен 20% дан 30% га чейин же андан көбү зыянкечтерден жана оору козгогучтардан жоголот, ал эми глобалдык жылуулук зыянкечтерге туруктуулукту жана түшүмдүн аялуулугун күчөтөт деп күтүлүүдө.4,5,6,7,8Пестициддерди иштеп чыгуу өсүмдүктөрдү зыянкечтерден коргоо жана вектор аркылуу жугуучу патогендердин жайылышын азайтуу үчүн гана эмес, ошондой эле пестициддерге барган сайын туруктуу болуп бараткан денге ысытмасы, безгек жана Шагас оорусу сыяктуу вектор аркылуу жугуучу адам ооруларына каршы күрөшүү үчүн да абдан маанилүү.5,9,10,11
Нейротоксикалык инсектициддердин негизги буталарынын арасында гетеротетрамердик TRPV каналы Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) акыркы он жылдыкта гана ачылган инсектициддердин буталарынын бир классын билдирет, анын ичинде имидаклоприд жана пираклостробин сыяктуу коммерциялык жактан жеткиликтүү инсектициддер бар.12,13,14Жарым синтетикалык инсектицид афидопирролифен (AP) – бул жакында эле иштелип чыккан жана коммерциялаштырылган продукт, анын негизги компоненти AP менен субнаномолярдык активдүүлүк деңгээлинде байланышуучу активдүү инсектицид Inscalis® болуп саналат.15AP чаңдаштыруучуларга, пайдалуу курт-кумурскаларга жана башка максаттуу эмес организмдерге анчалык күчтүү эмес уулуулугун көрсөтөт жана этикеткадагы көрсөтмөлөргө ылайык колдонулганда, ал башка инсектициддерге туруктуулук басымын төмөндөтө алат.16,17,18Нан жана Иав курт-кумурскалардын түрлөрү боюнча кеңири таралган, антенналардын жана буттардын хордалуу чоюлма рецептордук нейрондорунда гана биргелешип экспрессияланат жана угуу, тартылуу күчүн кабылдоо жана проприоцепция үчүн абдан маанилүү.13,16,19,20,21,22АП, имидаклоприд жана пираклостробин Nan-Iav комплексин уникалдуу механизм аркылуу стимулдайт, акырында проприоцептивдик сигналдын берилишин басаңдатат.13,16,23Биттер жана ак чымындар сыяктуу тешип соруучу курт-кумурскаларда (гемиптерандарда) проприоцепциянын жоголушу алардын тамактануу жөндөмүн начарлатып, акыры өлүмгө алып келет.13,24Кызыктуусу, AP Nan-Iav комплексине жогорку жакындыкты, ал эми Nanга гана төмөн жакындыкты көрсөтөт. APтин Nan-Iavга байланышы электр тогун индукциялайт, бирок Nanга гана байланышуу каналдын активдүүлүгүн стимулдаштырбайт. Iav өзү APге такыр байланышпайт.16Бул Nan жана Iav ар кандай Nan-Iav канал комплекстерин түзүү үчүн байланышып калышы мүмкүн экенин (мисалы, ар кандай стехиометриялык катыштар менен же бир эле стехиометриялык катыштын ичинде ар кандай жайгашуулар менен) же AP бир нече жерлерге байланышып калышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Андан тышкары, табигый агонист никотинамид (NAM) Drosophila Nan-Iav менен микромолярдык аффиндүүлүк менен байланышып, in vitro биттерге (AP) окшош эффекттерди көрсөтөт.16,25жана мите курттардын көбөйүшүнө жана азыктанышына тоскоол болуп, акыры алардын өлүмүнө алып келет25,26Бул маалыматтар көптөгөн суроолорду жаратат. Мисалы, Nan-Iav гетеродимери кантип пайда болгону, кичинекей молекулаларды модуляциялоо үчүн кайсы байланыш сайттары колдонулганы жана бул кичинекей молекулалар проприоцепцияны басуу менен канал функциясын кантип жөнгө салаары белгисиз бойдон калууда. Андан тышкары, Nanдын өзү эмне үчүн активдүү эмес жана APге төмөн жакындыкка ээ, ал эми Nan-Iav гетеродимери активдүү жана APге жогорку жакындык менен байланышат деген себептер белгисиз бойдон калууда. Акырында, Nan-Iav функциясынын Ca2+ көз каранды жөнгө салынышы жана анын нейрондук сигнал берүү процесстерине кантип интеграцияланганы жөнүндө аз маалымат белгилүү.. 13,21
Бул изилдөөдө, криоэлектрондук микроскопияны, электрофизиологияны жана радиолиганд байланыштыруу ыкмаларын айкалыштырып, биз Nan-Iav чогултуусун жана анын кичинекей молекулалык жөнгө салгычтарга байланышуу механизмин түшүндүрдүк. Андан тышкары, биз Iav жана AP менен турукташтырылган Nan пентамерлерине конститутивдүү байланышкан кальмодулинди (CaM) аныктадык. Бул жыйынтыктар каналдардагы кальций иондорунун жөнгө салынышы, каналдардын чогултулушу жана лиганддын байланышынын жакындыгын аныктоочу факторлор жөнүндө маанилүү түшүнүктөрдү берет. Андан да маанилүүсү, биз ARD бул процесстерде борбордук ролду ойной турганын тастыктадык. Тиешелүү айыл чарба пестициддерине байланышкан толук курт-кумурска каналдарын изилдөөбүз.27, 28, 29пестициддер өнөр жайын өнүктүрүү үчүн келечектерди ачат, пестициддердин натыйжалуулугун жана спецификасын жогорулатат, ошондой эле дүйнөлүк азык-түлүк коопсуздугу жана векторлор аркылуу жугуучу оорулардын жайылышын чечүү үчүн TRPVге багытталган кошулмаларды башка түрлөргө колдонууга мүмкүндүк берет.
Ошондой эле, биз Nan-Iav Ca2+ менен жөнгө салынаарын жана жөнгө салуу механизми конститутивдик түрдө байланышкан CaM менен ортомчулук кылынарын аныктадык. Маанилүүсү, CaM тарабынан Navдин бул Ca2+ көз каранды жөнгө салынышы башка иондук каналдардын (мисалы, чыңалуу менен чектелген Na+ каналдары жана TRPV5/6 каналдары) жөнгө салуу механизмдеринен олуттуу айырмаланат.52,53,54,55,56,57Nav1.2 каналында CaMдин С-терминалдык домени С-терминалдык домени (CTD) менен спираль түрүндө байланышат, ал эми Ca2+ өзүнүн N-терминалдык доменинин CTDнин дисталдык бөлүгүнө байланышын индукциялайт.56TRPV5/6 каналында CaMдин С-терминалдык домени CTH менен байланышат, ал эми Ca2+ өзүнүн N-терминалдык доменин тешикчеге өйдө карай жайылтууну индукциялайт, ошону менен катиондордун өткөрүмдүүлүгүн бөгөттөйт.53,54Биз Nan-Iav-CaMдин Ca2+ менен жөнгө салынуучу функциясынын моделин сунуштайбыз (4h-сүрөт). Бул моделде CaMдин N-терминалдык домени Iavдин C-терминалдык доменине (CTH) конститутивдүү түрдө байланышат. Тынч абалда (төмөнкү [Ca2+] концентрациясы), CaMдин C-терминалдык домени Nan менен өз ара аракеттенип, ARD конформациясын турукташтырып, ошону менен каналдын ачылышына өбөлгө түзөт. Агонист/инсектициддин каналга байланышы тешикчелердин ачылышын шарттайт, бул Ca2+ агымына алып келет. Андан кийин Ca2+ CaM менен байланышып, Nanдин ARDинен C-терминалдык домендин диссоциацияланышына алып келет. CaM байланышын бөгөттөө Ca2+ ингибирлөөчү таасирин жокко чыгаргандыктан, бул диссоциация ARD мобилдүүлүгүн модуляциялайт, ошону менен Ca2+ көз каранды ингибирлөөнү же десенсибилизацияны пайда кылат. Кальций ионун элюциялоодон кийин канал агымдарынын тез калыбына келиши (4g-сүрөт) бул механизм Ca2+ аркылуу нейрондук сигналдарга тез жооп кайтарууга көмөктөшөрүн көрсөтүп турат. Мындан тышкары, азырынча начар изилденген Иавдын С-терминалдык аймагы каналды бутага алууда жана учурдагы жөнгө салууда башка ролдорду ойной турганы кабарланган.21
Акырында, биздин изилдөө айыл чарба маанисине ээ болгон инсектицид-инсектицид TRP канал комплексинин жогорку чечилиштеги түзүлүшүн сунуштайт — бул ачылыш бизге мурда белгисиз болгон. Белгилей кетчү нерсе, биз курт-кумурскалардын клеткаларында эмес, адам клеткаларындагы (HEK293S GnTi–) курт-кумурскалардын каналынын түзүлүшүн жана функциясын мүнөздөдүк. Инсектициддерге туруктуулуктун өсүшүнө жана азык-түлүк коопсуздугуна жана патогендерге болгон үзгүлтүксүз кысымга карабастан, биздин ишибиз адамдардын ден соолугу жана глобалдык азык-түлүк коопсуздугу үчүн жаңы инсектициддерди иштеп чыгууга көмөктөшө турган маанилүү маалыматты берет. Изилдөөлөр көрсөткөндөй, AP сыяктуу инсектициддер этикеткадагы көрсөтмөлөргө ылайык колдонулганда айрым зыянкечтерге каршы натыйжалуу жана пайдалуу чаңдаштыргычтарга курч уулуулугу төмөн, бул алардын экологиялык коопсуздугун көрсөтөт.13,16Андан тышкары, чиркейлерде айрым AP туундуларын сыноо алардын акыры учуу жөндөмүн жоготорун көрсөттү. Бул модуляциялоочу кошулмалардын Nan-Iav менен кантип байланышаарын түшүнүү учурдагы кошулмаларды модификациялоого же жаңы кошулмаларды иштеп чыгууга жардам берет, бул натыйжалуураак жана натыйжалуураак болот.такзыянкечтерге каршы күрөшүү. Биздин изилдөө Nan-Iav ARD интерфейси эндогендик кошулмалардын, пестициддердин жана Ca2+-CaMдин активдүүлүгүн жөнгө салуу үчүн гана эмес, ошондой эле каналдарды чогултуу үчүн да маанилүү экенин көрсөтүп турат. Биз кичинекей молекулалар менен гетеродимерлердин чогултулушун үзгүлтүккө учуратуу ион каналдарынын ингибиторлорун иштеп чыгуу үчүн уникалдуу жана келечектүү ыкма болушу мүмкүн деп божомолдойбуз.
Сегиз ортологдук гендин ичинен күрөң коңуздун (Halyomorpha halys) толук узундуктагы гендери Nanchung жана Inactive тандалып алынган, алар жуугуч каражаттарда эң сонун туруктуулукту көрсөткөн. Синтезделген гендер адамдын экспрессиясы үчүн кодон боюнча оптималдаштырылган жана XhoI жана EcoRI рестрикциялык сайттарын колдонуу менен pBacMam pCMV-DEST векторуна (Life Technologies) клондолгон. Бул клондордун HRC-3C протеазасы (PPX) тарабынан бөлүнгөн C-терминалдык GFP-FLAG-10xHis жана mCherry-FLAG-10xHis тегдери менен рамкада болушун камсыз кылган, бул тегдер көз карандысызсөз айкашыНанчунг жана Инактивдүү праймерлерди pBacMam векторуна клондоо үчүн колдонулган праймерлер төмөнкүдөй болгон:
Жеке бөлүкчөлөрдүн микроскопиялык сүрөттөрү K3 камерасы жана Gatan BioQuantum энергия чыпкасы менен жабдылган Titan Krios G2 өткөргүч электрондук микроскобунда (FEI) алынган. Микроскоп 300 кэВде, энергия жөндөөсү 20 эВ, үлгү пикселинин өлчөмү 1,08 Å/пиксел (номиналдык чоңойтуу 81 000x) жана дефокус градиенти -0,8ден -2,2 мкмге чейин болгон. Видеожазуу номиналдык доза ылдамдыгы 25 e–px−1 s−1, экспозиция убактысы 2,4 с жана жалпы дозасы болжол менен 60 e–Å−2 болгон Latitude S микроскобу (Gatan) аркылуу секундасына 40 кадр ылдамдыгында жүргүзүлдү.
RELION 4.061 программасында MotionCor2 колдонуу менен пленкада нур менен индукцияланган кыймылды коррекциялоо жана дозаны салмактоо жүргүзүлдү. Контрасттык өткөрүү функциясынын (CTF) параметрлерин баалоо cryoSPARC программасында патч негизиндеги CTF баалоо ыкмасын колдонуу менен жүргүзүлдү62. CTF тууралоо чечими ≥4 Å болгон фотомикрографтар кийинки анализден алынып салынган. Адатта, cryoSPARC программасында чекит тандоо үчүн 500–1000 фотомикрографтын бир бөлүгү колдонулган, андан кийин шаблонго негизделген бөлүкчөлөрдү тандоо үчүн так шилтеме сүрөтүн алуу үчүн чыпкалоодон кийин 2D классификациясынын бир нече айлампасы жүргүзүлгөн. Андан кийин бөлүкчөлөр 64 пикселдик чектөө кутучалары жана 4 бүктөлүүчү биннинг аркылуу алынган. Каалабаган бөлүкчөлөрдүн категорияларын алып салуу үчүн 2D классификациясынын бир нече айлампасы жүргүзүлдү. Баштапкы 3D модели ab initio реконструкциясын колдонуу менен кайра курулган жана cryoSPARC программасында бирдей эмес тактоону колдонуу менен такталган. 3D классификация cryoSPARC же RELION программаларында ARD гетерогендүүлүгүнө негизделген. Мембрана домендеринин олуттуу гетерогендүүлүгү байкалган эмес. Бөлүкчөлөр C1 жана C2 ыкмаларын колдонуу менен такталган; C2 чечилиши жогору бөлүкчөлөр C2ге карата симметриялуу деп эсептелип, Байес ыкмасы менен тактоо үчүн RELIONго импорттолгон. Андан кийин бөлүкчөлөр акыркы бирдей эмес жана жергиликтүү тактоо үчүн кайрадан криоSPARCка өткөрүлүп берилген. Акыркы чечилиш жана бөлүкчөлөрдүн саны 1-таблицада көрсөтүлгөн.
Nan+AP пентамерлерин иштетүүдө биз мембрана домендеринин (айрыкча тешикчелер аймагынын) чечилишин жакшыртуунун ар кандай ыкмаларын, мисалы, сигналды кемитүү жана TMD маскасын изилдедик. Бирок, тешикчелер аймагындагы потенциалдуу өтө башаламандыктан жана TMDнин жалпы гетерогендүүлүгүнөн улам бул аракеттер ийгиликсиз болгон. Акыркы чечилиш cryoSPARCда бирдей эмес иштетүү ыкмасы менен автоматтык түрдө түзүлгөн масканы колдонуу менен эсептелген, негизинен ARD аймагына багытталган. Бул мембрана домендерине (айрыкча VSLD аймагына) караганда бир кыйла жогорку чечилишке жетишти.
Нанчунг жана активдүү эмес мүчүлүштүктөрдүн апо формаларынын баштапкы de novo моделдери алгач Coot63 колдонуу менен түзүлгөн, ал эми Нан жана Иав мүчүлүштүктөрүнүн моделдери ишенимдүүлүгү төмөн аймактарды аныктоо үчүн AlphaFold264 колдонуу менен түзүлгөн. Кальмодулин моделдөөсү тиешелүүлүгүнө жараша PDB 4JPZ56 жана 1CFD65 үлгүлөрүндөгү Ca2+ байланыштыруучу жана Ca2+ жок моделдердин катуу денеге туура келүүсүнө негизделген. Моделдер туура стереохимияны жана жакшы геометрияны камсыз кылуу үчүн сфералык тактоону колдонуу менен такталган. Андан кийин фосфатидилхолин, фосфатидилетаноламин жана фосфатидилсерин жакшы аныкталган липиддик тыгыздык катары моделделген, ал эми NAM жана AP лиганддары тыгыз түйүндөрдөгү тиешелүү тыгыздыктарга жайгаштырылган. PHENIX66дагы eLBOW колдонуу менен изоформалардын SMILES тизмегинен чектөө файлдары түзүлгөн. Акырында, моделдер PHENIXтеги реалдуу мейкиндикте жергиликтүү тор издөө жана экинчилик структуралык чектөөлөр менен глобалдык минималдаштырууну колдонуу менен такталган. Моделди тактоо жана структуралык анализ үчүн MolProbity сервери колдонулган, ал эми иллюстрациялар PyMOL жана UCSF Chimera X аркылуу аткарылган. 67,68,69 Диафрагманы анализдөө HOLE сервери аркылуу жүргүзүлгөн,70 ал эми ырааттуулукту сактоо картасын түзүү Consurf сервери аркылуу жүргүзүлгөн.71
Статистикалык анализ Igor Pro 6.2, Excel Office 365 жана GraphPad Prism 7.0 программаларын колдонуу менен жүргүзүлдү. Бардык сандык маалыматтар орточо ± стандарттык ката (SEM) катары берилген. Эки топту салыштыруу үчүн Стьюденттин t-тест (эки тараптуу, жупташпаган) колдонулган. Бир нече топторду салыштыруу үчүн Даннеттин пост-хок тестинен кийин бир тараптуу дисперсиялык анализ (ANOVA) колдонулган. *P< 0.05, **P< 0.01 жана ***P< 0,001 маалыматтардын бөлүштүрүлүшүнө жараша статистикалык жактан маанилүү деп эсептелген. Kd, Ki маанилери жана алардын асимметриялык 95% ишеним интервалдары GraphPad Prism 10 колдонуу менен эсептелген.
Изилдөө методологиясы боюнча кененирээк маалымат алуу үчүн, ушул макалада шилтеме берилген Nature Portfolio отчетунун кыскача мазмунун караңыз.
Баштапкы модель PDB 4JPZ жана 1CFD маалымат базаларынан кальмодулин моделдерин колдонуу менен курулган. Координаттар Белок маалыматтар банкына (PDB) 9NVN (лигандсыз Nan-Iav-CaM), 9NVO (никотинамидге байланышкан Nan-Iav-CaM), 9NVP (никотинамидге жана EDTAга байланышкан Nan-Iav-CaM), 9NVQ (афенидолпирроллинге жана кальцийге байланышкан Nan-Iav-CaM), 9NVR (афенидолпирроллинге жана EDTAга байланышкан Nan-Iav-CaM) жана 9NVS (афенидолпирроллинге байланышкан Nan пентамер) номерлери менен сакталган. Тийиштүү криоэлектрондук микроскопия сүрөттөрү Электрондук микроскопия маалыматтар базасына (EMDB) төмөнкү каттоо номерлери менен жайгаштырылган: EMD-49844 (лигандсыз Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (никотинамид кошулган Nan-Iav-CaM комплекси), EMD-49846 (никотинамид жана EDTA кошулган Nan-Iav-CaM комплекси), EMD-49847 (афидопирроллин жана кальций кошулган Nan-Iav-CaM комплекси), EMD-49848 (афидопирроллин жана EDTA кошулган Nan-Iav-CaM комплекси) жана EMD-49849 (афидопирроллин кошулган Nan пентамер комплекси). Функционалдык анализ үчүн чийки маалыматтар ушул макалада келтирилген.
Жарыяланган убактысы: 2026-жылдын 28-январы